שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin
Summary
After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.
Abstract
Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.
Introduction
שידור סינפטי מתווך על ידי exocytosis של שלפוחית סינפטית המכיל מוליך עצבי, ושלפוחית אלה חייבת לעבור מחזור endocytic מקומי במסוף העצב לשמור על תקשורת עצבית בטווח הארוך. בהתחשב בתפקיד החיוני של שידור סינפטי במוח, הבנת המנגנון המולקולרי המהווה את מעגל השלפוחית הסינפטית הוא בסיס חיוני להבנה טובה יותר בתקשורת הסלולרית בכללותו. בין מערכות מודל תא, תא chromaffin יותרת הכליה סיפק כמה תובנות העקרוניות ביותר למכונות מולקולריות שבבסיס מחזור שלפוחית הסינפטית. Exocytosis, השלב האחרון בשחרור הנוירוטרנסמיטר, נחקר מאוד ובחן באמצעות השימוש בתאי chromaffin יותרת הכליה 1,2. למעשה, רוב השחקנים המולקולריים שלתזמר את ההיווצרות, מיקוד, עגינה, ושילוב של גרגרי הפרשה זוהו בשל יישום של divטכניקות erse בתאי chromaffin 1. יתר על כן, על ידי מתן הזדמנות לאפשר לרזולוציה יחידה שלפוחית של מכונות החלבון מעורבות בexocytosis, תא chromaffin נשאר מודל רב עוצמה כדי לענות על השאלות של שלפוחית היתוך 3.
מדידות קיבול מצורף תא נוצלו ראשונה בפתרון היתוך יחיד שלפוחית במהלך exocytosis 3. Exocytosis של שלפוחית קטנה כמו ~ 60 ננומטר בקוטר הוכח להיות מזוהה על ידי מדידות להתקבל קרום תא עם טכניקת מהדק תיקון בתצורת התא מצורף 4-7. אדמיטנס מוגדר כמדד של כמה בקלות מעגל או התקן יאפשר לזרם לזרום; זה הוא ההופכי של עכבה. לפיכך, מדידות להתקבל לספק הבנה של קיבול הקרום. המטרה זו מושגת על ידי השילוב של קרום לפוחי לתוך קרום הפלזמה; התאגדות זו חושפת שינויים במשטחאזור 8. כל שלפוחית פיוזינג גורמת לעלייה הדרגתית ב9,10 קיבול קרום. בנוסף, מדידה להתקבל זה מספקת את מוליכות הממברנה ומוליכות נקבוביות ההיתוך במהלך אירוע exocytotic 3. כטכניקה זו סיפקה כלי ייחודי בזיהוי קינטיקה יחידה שלפוחית במהלך exocytosis, המעבדה שלנו לאחרונה מיושמת תפיסה זו כדי לזהות אנדוציטוזה של שלפוחית אחת 11,12.
העניין הספציפי שלנו הוא אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME), שכבר נחשב כמרכיב ניהול משק בית בסיסי בתאים רבים 13 וכדרך הראשית לאנדוציטוזה שלפוחית הסינפטית במסופים עצביים 14,15. CME ידוע להיות חשוב מבחינה ביולוגית, לעומת זאת, קינטיקה שלה תישאר לא מובנת היטב בשל מגבלות טכניות בניטור אירועי endocytic ייחודיים. בהתחשב בקווי הדמיון במנגנוני exocytic בין תאים ונוירונים 1 chromaffin, זה plausible שמנגנוני הביקוע בתאי chromaffin עשויים עשויים לחול על אנדוציטוזה שלפוחית הסינפטית בתאי עצב. מדידות הקיבול מצורף התא כבר נוצלו כדי לעקוב אחר אירועי endocytic בודדים ולנתח את קינטיקה הביקוע, שרוב השיטות לא מצליחות לפתור. בהקלטות מצורפים התא שלנו, גל סינוס ב20 kHz משולב לתוך פוטנציאל ההחזקה, והתפוקה הנוכחית מופרד למוליכות קרום בקיבול ערוץ וקרום אחד בערוץ האחר משני שלבי נעילה ב מגבר 16- 18. מהשינויים במוליכות הממברנה וקיבול, ניתן לחשב את קינטיקה של הביקוע נקבובי, שסביר להניח מתאים לצוואר קרום הצינור שמחבר את שלפוחית ההפנמה לקרום הפלזמה לפני שלפוחית קמצוץ-off. באופן קולקטיבי, טכניקה זו נותנת לנו את ההזדמנות כדי לבחון את מנגנוני הוויסות של ביקוע שלפוחית במהלך CME.
Protocol
Representative Results
Discussion
מדידות קיבול מצורף תא דורשות כמה שלבים קריטיים על מנת להשיג הצלחת הקלטות באיכות גבוהה: 1) תאי קיימא ובריאים שהוכנו מבלוטת יותרת הכליה; 2) ציפוי PDL של coverslips; 3) היווצרות חותמת gigaohm; רמת רעש של המערכת 4); ו5) תיקון שלב.
לניתוח של בעלי חיים, ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a National Science Foundation award (1145581) to LWG.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100mL |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter-1.5 mm |
| Inner diameter 1.10 mm | |||
| Length- 10 cm |
Referências
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).
- Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389, 509-512 (1997).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration. Biophys J. 75, 53-59 (1998).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel. The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).
- Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release. Nat Methods. 2, 699-708 (2005).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore. Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).
- Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).
- Yao, L. H., et al. Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).
- Yao, L. H., et al. Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).
- Murthy, V. N., De Camilli, P. Cell biology of the presynaptic terminal. Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Rosenboom, H., Lindau, M. Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).
- MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells. Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).
- Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z). J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).
- Debus, K., Lindau, M. Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles. Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).
