Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em> Escherichia coli</em> Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan deneyleri, ulusal ve Avrupa mevzuatına uyduğu ve Eczacılık UCL Okulu Etik Komitesi ve İngiltere Home Office (HO) tarafından onaylanmıştır. HO projesi kapsamında yürütüldüğü bütün hayvan çalışmaları PPL 80/2243 ve PPL 70/7773 lisanslar. 1. Fare Hazırlama Patojen-free Wistar neonatal sıçan kullanarak tüm in vivo deneyler yürütmek. 21 ° C, 45 – -% 55 nem, 15-20 hava değişikliği / saat ve optimum koşullarda (19 altında, – (11 haftalık kadın 9) kendi emzikli anneler ile bireysel kafeslere tüm sıçan ibrelerin (koloni başına 12 yenidoğan) saklayın 12 st ışık / karanlık döngüsü). 2. Bakteriyel hücrelerin hazırlanması Mağaza E. -80 ° C'de% 20 (h / h) gliserol, E. coli K 1 stokları. Her deney için, agar plakaları Mueller-Hinton (MH) üzerine stok bakterileri plaka ve 37 ° CO / N inkübe. Beslenme, inocu gün önceBir tek E ile MH suyu geç 10 mi E. coli K1 koloni ve kültür O / 37 ° C, 200 rpm'de K. Orta kontaminasyonu için bir kontrol olarak, aşılanmamış MH suyu 10 ml hazırlamak ve 200 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin. Aktarım MH suyu 9,9 ml 'si içerisine göre O / N bakteri süspansiyonu, 100 ul (1: 100 hacim / hacim), ve orta üslü faz 0.6' lik bir optik yoğunluğa karşı gelen, ulaşana kadar, 37 ° C, 200 rpm'de inkübe 600 nm (OD 600), bir dalga boyunda ölçülmüştür. E. ile Yenidoğan Sıçan 3. Besleme coli K1 Yavaşça ağız açmak için izin, ensesinden tek elle dikey hayvan tutun. Yavaşça hayvanın ağzına Steril bir pipet ucu yerleştirin ve 30 saniyelik bir süre boyunca hayvanın ağzına aşı (~ 37 ° C) pipet 20 ul. Hemen beslendikten sonra annesine hayvan dönün. 8 x 10 6 bakteri t beslenmiş – 4 doğrulayıno seri PBS inokulum seyreltme ve MH agar plakaları üzerine tespit ederek, her yavru. E. tarafından Kolonizasyon 4. Değerlendirme coli K1 Yavaşça ensesinden itibaren bir yandan hayvan tutun. Steril PBS içinde steril pamuk uçlu çubukla ıslatın ve sonra yavaşça perianal bölgeyi çubukla. Hemen swabbing sonra anne hayvan dönün. Steril PBS içinde 300 ul ihtiva eden bir tüp içine pamuklu çubuk ucu ile ve buz üzerinde muhafaza edin. PBS içinde seri seyreltme ile canlı bakteri sayısını belirlemek MacConkey agar plakaları üzerine kaplama. Canlı E. belirleyin bakteriyofaj duyarlılık testleri ile coli K1. Steril bir mikrobiyolojik döngü kullanarak bireysel bir koloni almak, girdap karıştırma sonra tabi steril PBS, 200 ul içine batırılmış. Düz bir çizgi MH agar üzerine steril bir mikrobiyolojik döngü, alt-kültür kullanarak. Plaka 30 saniye süreyle kurumaya, ve sonra bac 10 ul pipet izin verteriophage K1E çizgisinin merkezi üzerine (10 9 plak birim / ml (pfu / mL) oluşturulması). 37 ° C'de plaka O / N inkübe edin. Bir sonraki gün, bakteriyofaj aracılı liziz için plaka inceleyin. Hastalık Şiddeti 5. Değerlendirme Tablo 1'de özetlenen yedi nokta skorlama sistemi kullanılarak 5 kez günlük – 4 her bir hayvanın hastalık şiddetini değerlendirmek. Bir hayvan puanları 7 takım ≥3, hemen acıyı en aza indirmek için hayvan itlaf. Ölü hayvan kaydedin. Yenidoğan Sıçanlar ve Kan Toplama 6. Euthanization Yavaşça başını ve boynunu açığa bir yandan hayvan tutun. Alkollü bir bezle silerek hayvanın boynunu dezenfekte edin. Iz etanolü çıkarmak için steril PBS içinde yıkamadan önce,% 70 etanol kullanılarak makas büyük bir çift dezenfekte. Yavaşça bir Petri kabı üzerinde doğrudan hayvan tutun. Keskin Surgi kullanarak yenidoğan işten çıkarmakKan Petri kabı içine damlalar sağlamak cal makas. Cilt florası ile kan bulaşmasını önlemek için kafa temastan kaçının. Hemen bir steril pipet kullanılarak, kan toplamak ve 20 arasında bir konsantrasyonda, heparin, sodyum tuzu ile karıştırmak – 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 50 birim / ml. PBS içinde seri seyreltme ile canlı bakteri sayısını belirlemek MacConkey agar plakaları üzerine kaplama. Canlı E. numaraların belirlenmesidir bakteriyofaj K1E için canlı bakteri duyarlılığını test ederek coli K1. 7. Diseksiyon Neonatal sıçan Dekapitasyon takiben, tüketim ve ilgi dokuları toplamak için aseptik koşullarda kullanın. % 70 etanol ve steril PBS içinde (Şekil 1 'de gösterildiği gibi) tüm araçları yıkayın. Diseksiyon kurulu temizleyin ve% 70 etanol ile tamamen karın ıslak. Sol arka bacak çivileme sırtında cesedi yerleştirin ve (i) diseksiyon kurulu düzeltmeksteril bir iğne ile operasyon masası, (ii) cesedi germe ve işlem tablosuna doğru ön bacağını bağlantılarını, (iii) işlem tablosuna, sağ arka bacak, sol ön bacağını çivileme. Forseps kullanarak alt karın sol tarafında deri çekin, sonra küçük diseksiyon makas kullanılarak sternum alt karın cesedin sol tarafında kesti. Sternum eksizyonu uzatın ve ardından altta yatan yapıların hiçbirinin hasar sağlanması forseps ve küçük diseksiyon makas kullanarak alt karın sternum cesedin sağ tarafında, aşağı. Son olarak, yavaşça periton maruz İris kavisli diseksiyon forseps kullanarak alt karın sternum flep aşağı çekin. Temel organlarının hiçbirinin hasar sağlanması, forseps ile yavaşça periton yükseltmek ve iç organları açığa dikey kesilmiş. 8. ToplamaGI Yolu Mide, ince bağırsak, çekum, kolon ve mezenterik lenf sistemi tanımlamak. Yavaşça iki tarafında transecting tarafından mide kaldırmak, daha sonra steril forseps kullanarak steril PBS 1.6 ml içeren bir bijou içine koyun. Rektum kolon transect. Dikkatlice steril Petri kabındaki diseksiyon forseps ve yer kullanarak cesedinden tüm bağırsak kitle çekin. Bağırsak yapısı ve mezenterik lenf yapıları ayrı kalmamanız bu nazikçe yapılır emin olun. GI sistemi ve mezenterik lenf Sistemin 9. Ayırma (Şekil 2) Gastrointestinal sistem tamamen daldırılır sağlanması, bir Petri kabı içine steril PBS, 30 ml dökün. Mezenterik lenf sisteminin merkezi kitle tespit ve ince diseksiyon forseps kullanarak çimdik. Ince bağırsağın proksimal kısmına tespit ve ince diseksiyon forseps kullanarak çimdik. Yavaşça Centra çekinmezenterik lenf sistemi ve iki doku kadar bunları karşıt istikametlerde distal ince bağırsağın L kütle bütünüyle birbirinden ayrılır. Bu proksimal, orta ve distal bölgelerde tekrarlanabilir toplanmasını engeller olarak, ince bağırsak gergin değil emin olmak için dikkatle bu işlemi gerçekleştirmek. 300 mezenterik lenf sistemi yerleştirin – steril PBS içinde 500 ul ve buz üzerine yerleştirin. GI Yolu 10. Kesit Kolondan gelen ince bağırsağa ayırmak için çekum de gastrointestinal sistem transeksiyonu. 300 kolon yerleştirin – 500 ul steril PBS ve buz üzerine yerleştirin. İnce bağırsak, yakın orta ve uzak bölgelerden gelen temsilcisi dokuları toplayın. Orta noktasından ince bağırsak hizalayın. Daha sonra, (i) distal ince bağırsak gibi çekuma önce doku son 2 cm toplanması, (ii) 5 den doku toplamak – yakınsal ince bağırsak gibi orta noktasının üzerinde 7 cm, veOrta ince bağırsak gibi orta noktasının altında 5 cm -, (iii) 3 'den gelen doku toplanır. 11. Karaciğer Toplama Mide çıkarılmasından sonra sıçan karaciğer üç lobu belirlenmesi. Uzakta ince diseksiyon forseps kullanılarak karın boşluğundan lobları çekin. Ince makas kullanarak herhangi takılarak ligament kesilerek karaciğer çıkarın. Buz üzerinde 500 ul steril PBS ve yer – 300 karaciğer yerleştirin. 12. Dalak Toplama Dalak tanımlayın. Uzakta mide dalak çekin ve gastrosplenic ligament kesmek için ince makas kullanın. Buz üzerinde 500 ul steril PBS ve yer – 300 dalak yerleştirin. 13. Böbrekler Toplama Gastrointestinal sistem ve diğer organ çıkarılmasından sonra karın boşluğunun arka görülebilir hale gelecektir böbrekleri belirlenmesi. Kesim üreter ve herhangi takılarak ligament uince diseksiyon makas şarkı ve ince forseps kullanılarak böbrekleri kaldırın. Adrenal bezleri ve ince forseps ve diseksiyon makas kullanılarak (hala bağlıysa) herhangi bir yağ malzemelerini çıkarın. 300-500 ul steril PBS içinde her iki böbreği koyun ve buz üzerine yerleştirin. 14. Beyin Toplama Başlarının kesilmesi işleminden sonra, kıvrık forsepsler kullanılarak dik bir konumda kafa tutun. Uzunlamasına kavisli bir forseps başka bir dizi kullanarak başınızın üstüne cilt Pinch, ve ince diseksiyon makas kullanarak bir kesi yapmak. Boyun yakın kalan cilt, yine uzunlamasına ince diseksiyon makas kesti. Ince diseksiyon makas kullanılarak deri kanatlar kafatası ortaya ve ortadan kaldırmak her iki tarafta ince forseps kullanarak dışa doğru cilt çekin. Spinal açılış ince diseksiyon makas yerleştirin ve kürsüden doğru kafatası boyunca bir kesi yapmak. Ince forseps kullanarak dışarıya doğru bir yönde kafatası iki bölümünü de çekin. Kafatası parçalarını kaldırmak için kesti. <li> kürsüsünden doğru spinal açıklıktan yukarı doğru bir scooping hareket kullanan, geniş forseps kullanarak beyin çıkarın. Decapitation prosedürden herhangi bir kan çıkarmak için iki kez PBS içinde beyin yıkayın. 15. Doku İşleme ve Homojenizasyon Steril PBS içeren tüpler içine canlılığı sayım veya DNA çıkarma, yer dokuları gerektiren deneyler için. Hemen kısa dönem için% 20 gliserol ile, -20 ° C'de PBS içinde seri seyreltme ve MacConkey agar plakaları üzerine kaplama veya deposu tarafından canlı bakteri sayısını belirler. DNA ekstraksiyonu, -20 ° C'de mağaza dokular için. RNA ekstraksiyonu, RNAlater çözeltisinin uygun hacim içine bir yer dokular (1 mg doku başına 10 ul) gerektiren deneyleri için, daha sonra, kısa süreli ya da -80 ° C'de uzun süreli depolama -20 ° C 'de hemen saklayın. 10 mi metakarn çözeltisi içinde görüntüleme gerektiren deneyler, bir yer dokularda (% 60 metanol,% 30 kloroform ve% 10 asetik asit), daha sonra da bir mağazat RT – 3 haftaya kadar (20 25 ° C). Önce ve dokulara ilave edildikten sonra tüpler ağırlıkça karşılaştırılmasıyla doku ağırlığı hesaplayın. Bir homojenleştirici kullanılarak dokular homojenize edilir. Her numunenin homojenleştirilmesi arasında, steril PBS içinde bir kez% 70 etanol ile iki kez homojenize edici yıkayın. NOT: metakarn sabitleme müsin ilgili mukozal savunma yapılarını korumak amacıyla bağırsak örneklerinin tespiti için arzu edilir; Formalin sabitleme sistemik dokular için kullanılabilir.