JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

نموذج غير الغازية من ممرض للأعصاب<em> الإشريكية القولونية</em> العدوى في الأطفال حديثي الولادة الجرذ

Published: October 29, 2014
doi:
10.3791/52018
, , , ,
1School of Pharmacy,University College London, 2Mucin Biology Group,University of Gothenburg

Summary

هنا، يتم وصف هذا الإجراء لإنشاء العدوى النظامية في الفئران حديثي الولادة مع ثقافات القولونية K1. يسمح هذا الإجراء غير الغازية استعمار الجهاز الهضمي، النبات من الممرض إلى الدوران الجهازي، وغزو النظام العصبي المركزي في الضفيرة المشيمية.

Abstract

التحقيق في التفاعلات بين المضيف الحيواني والممرض الجرثومي هو معنى فقط اذا كان النموذج إصابة العاملين يعيد ملامح الرئيسية للعدوى الطبيعية. يصف هذا البروتوكول الإجراءات لإنشاء وتقييم العدوى النظامية بسبب ممرض للأعصاب K1 القولونية في الفئران حديثي الولادة. استعمار الجهاز الهضمي يؤدي إلى نشر الممرض على طول مجرى القناة الهضمية-الليمفاوية الدم في الدماغ من الإصابة ويعرض نموذج الإعالة العمرية قوية. سلالة من E. القولونية O18: K1 مع تعزيز الفوعة للجرذ حديثي الولادة ينتج معدلات عالية بشكل استثنائي من الاستعمار، النبات إلى المقصورة الدم وغزو السحايا بعد المرور عبر الضفيرة المشيمية. كما هو الحال في الإنسان المضيف، ويرافق اختراق الجهاز العصبي المركزي التهاب المحلي والنتيجة فتاكة دائما. هذا النموذج هو لفائدة ثبت للدراسات آليةالمرضية، لتقييم التدخلات العلاجية وتقييم الفوعة البكتيرية.

Introduction

التهابات جرثومية جهازية تشكل تهديدا كبيرا للرفاه وبقاء الأطفال حديثي الولادة. الخدج أكثر عرضة بشكل خاص. التهاب السحايا الجرثومي حديثي الولادة (NBM)، وكثيرا ما يرتبط مع الإنتان الجرثومي، لا يزال يشكل مصدرا مهما للوفيات والمراضة أثناء الأسابيع القليلة الأولى من الحياة، وتفاقم المشكلة عن طريق التطور المستمر للمقاومة لعقاقير مضادة للجراثيم المواجهة 1،2. وهناك حالة من NBM حالة طبية طارئة أن يحمل عبء الطبي والاجتماعي والاقتصادي المرتفع 3؛ وبالتالي، هناك حاجة ملحة لعلاجات جديدة وخاصة، استراتيجيات وقائية جديدة للحد من عبء المرض. بعض ملامح NBM غير عادية: في العالم المتقدم، كولاي والمكورات العقدية المجموعة الثانية هي المسئولة عن الغالبية العظمى من الحالات وقدرة هذه السلالات لانتزاع NBM يكاد يرتبط دائما مع وجود السكاريد كاليفورنيا الواقيةpsule تمكن الممرض للتهرب من الاعتراف المناعة العمليات 4. وهناك نسبة عالية جدا (80-85٪) من neuroinvasive E. القولونية التعبير عن كبسولة K1 5،6، وهو بوليمر حمض polysialic المرتبطة α-2،8 مطابق هيكليا لاستضافة جهري من اللدونة العصبية 7.

ان تقييم علاجات جديدة واقية لNBM وتجرثم الدم والإنتان المرتبطة تستفيد بشكل واضح من نموذج حيواني قوية من العدوى التي يحاكي الملامح الرئيسية لهذا المرض في الوليد البشري، ولا سيما قوية سن التبعية والمسار الطبيعي للعدوى . وهناك مجموعة واسعة من النماذج لالتهاب السحايا الجرثومي إيجابية الجرام وسالبة الجرام متاحة 8،9 وهذه لها بمد كبير معرفتنا خيارات المرضية، الفيزيولوجيا المرضية والعلاج في هذه الالتهابات. وبالتالي، استخدمت الالتهابات التجريبية في الجرذان والفئران والأرانب والقردة لدراسة التهاب السحايا في كل من نeonate والكبار. ومع ذلك، فإن العديد من هذه النماذج تستخدم حقن الصهريج أو تحت الجلد مباشرة من البكتيريا لبدء العدوى، وخلق التسبب الاصطناعي من خلال تجاوز العمليات الطبيعية للنشر من موقع الاستعمار. في بعض الحالات أدت هذه الأساليب التلقيح إلى تغييرات كبيرة في علم الأمراض. على سبيل المثال، الإدارة تحت الجلد من E. ألغت سلالات القولونية K1 للالإعالة العمرية المرتبطة عدوى الطبيعي، وتنتج تجرثم الدم والغزو من الجهاز العصبي المركزي (CNS) في كل من حديثي الولادة والبالغين 10. الاستعداد لE. القولونية NBM يعتمد بشكل حاسم على الانتقال الرأسي للعامل المسبب للمرض من الأم إلى الرضيع عند أو بعد الولادة مباشرة 11. أمومي المستمدة من E. البكتيريا القولونية K1 استعمار الجهاز الهضمي حديثي الولادة (GI) المسالك 11-13، والتي هي عقيمة عند الولادة ولكنه يكتسب الجراثيم معقدة بسرعة 14. في حديثي الولادة المستعمر، E. القولونيةK1 البكتيريا لديها القدرة على نقل من من لمعة الأمعاء إلى الدورة الدموية الجهازية قبل الدخول إلى الجهاز العصبي المركزي في الدماغ عبر الدم أو الدم النخاعي الحواجز السوائل 9،15. تصميم نماذج قوية من العدوى التجريبية يجب أن تأخذ بعين الاعتبار هذه التفاصيل.

على الرغم من أن الفئران التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة بعض أشكال التهاب السحايا الجرثومي 8، فهي غير صالحة للدراسات عدوى حديثي الولادة: يتم طغت من قبل الإصابة الجهازية وعدم إظهار السمة الإعالة العمرية قوية للرضع الإنسان 16. وعلاوة على ذلك، defensins α، الببتيدات الرئيسية الجهاز الهضمي توفير الحماية ضد الغزو النظامية التي كتبها E. القولونية K1 17، يتم التعبير بشكل كبير في خلايا بانيت والعدلات في البشر والفئران ولكن ليس في الفئران (18). هناك درجة ملحوظة من الازدواجية والتكرار وعدم التجانس في الماوس defensin والجينات cryptidin ذات الصلة التي لا توجد في غيرها وimals 19. وقد استخدمت الفئران حديثي الولادة في البداية من قبل Moxon وزملاء العمل 20 للتحقيق في الآلية المرضية لالتهاب السحايا المستدمية النزلية بعد التلقيح داخل الأنف، تكرار الموقع الطبيعي للاستعمار هذا الممرض حديثي الولادة في الإنسان، وتكييفها لاحقا لتعتمد على سن E. القولونية K1 تجرثم الدم والتهاب السحايا. Bortolussi وآخرون 21 حقن داخل الصفاق العاملين من اللقاح البكتيري لبدء الإصابة ولكن الدراسة الرئيسية Glode وزملاء العمل 22 المستخدمة للتغذية في المعدة عن طريق الفم موازية الطريق الطبيعي للعدوى بعد GI الاستعمار. كما أنبوب المعدة قد يضر الأسطح المخاطية، وقد تم تطوير هذا الإجراء ليشمل التغذية من اللقاح إلى الأطفال حديثي الولادة 23. هنا، وطريقة للاستعمار الجهاز الهضمي وإجراءات لتتبع العدوى في وصفها الفئران الوليدة الحساسة؛ بالإضافة إلى ذلك، تمت مناقشة التطبيقات العلاجية والوقائية للنموذج.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات التي أجريت في هذه الدراسة متفقة مع التشريعات الوطنية والأوروبية وتمت الموافقة من قبل اللجنة الأخلاقية لمدرسة الصيدلة، جامعة لندن وزارة الداخلية البريطانية (HO). كل عمل الحيوان أجريت في إطار مشروع HO تراخيص PPL PPL 70/7773 80/2243 و. 1. إعداد الجرذ تنفيذ جميع التجارب المجراة باستخدام خالية من مسببات الأمراض الفئران حديثي الولادة ويستار. الاحتفاظ بجميع الفضلات الفئران (12 حديثي الولادة في مستعمرة) في أقفاص فردية مع أمهات المرضعات من (9-11 أسبوع الإناث القديمة)، في ظل ظروف مثلى (19-21 درجة مئوية، 45 – 55٪ رطوبة، 15-20 التغيرات الجوية / ساعة و 12 ساعة ضوء / دورة الظلام). 2. إعداد الخلايا البكتيرية متجر E. الأسهم القولونية K1 في 20٪ (V / V) الجلسرين في -80 درجة مئوية. لكل تجربة، لوحة من البكتيريا الأسهم على مولر-هينتون (MH) أجار لوحات، واحتضان عند 37 درجة CO / N. قبل يوم والتغذية، inocuمتأخرة 10 مل من مرق MH مع E. واحد القولونية K1 مستعمرة والثقافة O / N عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة. كوسيلة لمراقبة تلوث المتوسط، وإعداد 10 مل من مرق uninoculated MH واحتضان عند 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة. نقل 100 ميكرولتر من O / N تعليق البكتيرية إلى 9.9 مل من مرق MH (1: 100 ت / ت)، واحتضان عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة، حتى يتم التوصل إلى منتصف المرحلة الأسي، وهو ما يمثل كثافة ضوئية 0.6 يقاس عند طول موجي 600 نانومتر من (OD 600). 3. تغذية الفئران حديثي الولادة مع E. القولونية K1 عقد بلطف الحيوان عموديا في يد واحدة من القفا من الرقبة، مما يسمح لفتح الفم. إدراج ببطء غيض ماصة معقمة في فم الحيوان، وماصة 20 ميكرولتر من اللقاح (~ 37 درجة مئوية) في فم الحيوان خلال فترة زمنية 30 ثانية. عودة الحيوان إلى أمه مباشرة بعد الرضاعة. تحقق من 4 – 8 × 10 6 البكتيريا تم تغذيتها ريا كل الجرو من قبل التخفيف التسلسلي للاللقاح في برنامج تلفزيوني ولمح على لوحات أجار MH. 4. تقييم الاستعمار من قبل E. القولونية K1 عقد بلطف الحيوان في يد واحدة من القفا من الرقبة. بلل من القطن ذات الرؤوس مسحة معقمة في برنامج تلفزيوني العقيمة، ثم مسحة بلطف المنطقة حول الشرج. عودة الحيوان إلى أمه مباشرة بعد ينظف. وضع غيض مسحة في أنبوب يحتوي على 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة وتخزينها على الجليد. تحديد أعداد البكتيريا قادرة على البقاء من خلال التخفيف التسلسلي في برنامج تلفزيوني والطلاء على لوحات أجار ماكونكي. تحديد قابلا للتطبيق E. القولونية K1 من قبل عاثية اختبار الحساسية. اختيار مستعمرة الفردية باستخدام حلقة الميكروبيولوجية العقيمة، انخفض إلى 200 ميكرولتر العقيمة PBS، ثم يخضع لدوامة الاختلاط. باستخدام حلقة الميكروبيولوجية العقيمة، والثقافة الفرعية على MH أجار في خط مستقيم. تسمح لوحة لتجف لمدة 30 ثانية، ثم ماصة 10 ميكرولتر من البكالورياK1E teriophage (10 9 البلاك تشكيل وحدة / مل (PFU / مل)) على مركز الخط. احتضان لوحة O / N عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، ودراسة لوحة بوساطة الجراثيم تحلل. 5. تقييم شدة المرض تقييم شدة المرض من كل حيوان 5 – 4 مرات يوميا باستخدام نظام تسجيل النقاط السبع الواردة في الجدول 1. إذا كان عشرات الحيوانات ≥3 من أصل 7، اعدام فورا الحيوان لتقليل المعاناة. تسجيل الحيوان في عداد الموتى. 6. Euthanization من الفئران حديثي الولادة وجمع الدم عقد بلطف الحيوان في يد واحدة، وتعريض الرأس والرقبة. تطهير عنق الحيوان من خلال المسح مع مسحة الكحول. تطهير زوج كبير من مقص باستخدام الايثانول 70٪، قبل الشطف في برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة الإيثانول أثر. عقد بلطف الحيوان مباشرة فوق طبق بيتري. قطع رأس الوليد باستخدام surgi حادمقص كال، وضمان أن الدم يقطر في طبق بيتري. تجنب الاتصال مع رئيس لمنع تلوث الدم مع فلورا الجلد. جمع الدم فورا باستخدام ماصة معقمة ويخلط مع الملح هيبارين الصوديوم بتركيز من 20-50 وحدة / مل في أنبوب 0.5 مل ميكروسنتريفوج. تحديد أعداد البكتيريا قادرة على البقاء من خلال التخفيف التسلسلي في برنامج تلفزيوني والطلاء على لوحات أجار ماكونكي. تحديد أعداد قابلة للحياة E. القولونية K1 عن طريق اختبار حساسية البكتيريا قادرة على البقاء لK1E عاثية. 7. تشريح بعد قطع الرأس من الفئران حديثي الولادة، واستخدام ظروف معقمة لاستئصال الأنسجة وجمع من الفائدة. غسل جميع الصكوك (كما هو موضح في الشكل رقم 1) في الايثانول 70٪ وبرنامج تلفزيوني العقيمة. تنظيف لوحة تشريح والرطب البطن تماما مع الايثانول 70٪. وضع الجثة على ظهرها وإصلاح لوحة تشريح من قبل (ط) تعلق على الساق الخلفية اليسرى لالجدول عملية بإبرة معقمة، (ب) تمتد الجثة وتعلق الرجل الاماميه اليمنى إلى طاولة العملية، (ج) يعلق الحق في الساق الخلفية اليسرى والرجل الاماميه الى طاولة العملية. سحب الجلد على طول الجانب الأيسر من أسفل البطن باستخدام ملقط، ثم قص على طول الجانب الأيسر من الجثة من أسفل البطن إلى القص باستخدام مقص تشريح الصغيرة. تمديد الختان عبر القص، ثم أسفل الجانب الأيمن من جثة من القص إلى أسفل البطن باستخدام ملقط ومقص تشريح الصغيرة، وضمان أن أيا من الهياكل الأساسية معطوبة. أخيرا، وسحب بلطف إلى أسفل رفرف الجلد من القص إلى أسفل البطن باستخدام ملقط تشريح القزحية المنحنية لفضح الصفاق. بلطف رفع الصفاق مع ملقط وقطع عموديا لكشف الأعضاء الداخلية، وضمان أن أيا من الأجهزة الأساسية معطوبة. 8. جمعوالجهاز الهضمي التعرف على المعدة والأمعاء الدقيقة، الأعور والقولون والجهاز اللمفاوي المساريقي. إزالة المعدة من قبل transecting برفق على جانبي، ثم وضع في بيجو تحتوي على 1.6 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة باستخدام ملقط معقم. القطع القولون في المستقيم. سحب بعناية الكتلة المعوية بالكامل من جثة باستخدام ملقط تشريح وضعها في طبق بتري معقمة. ضمان أن يتم ذلك بلطف بحيث بنية الأمعاء والهياكل الليمفاوية المساريقي لا تنفصل. 9. فصل من الجهاز الهضمي والجهاز اللمفاوي المساريقي (الشكل 2) صب 30 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة في طبق بيتري، وضمان الغارقة الجهاز الهضمي بالكامل. تحديد الكتلة المركزية من الجهاز اللمفاوي المساريقي، وقرصة باستخدام ملقط تشريح غرامة. تحديد الجزء الأكثر الداني من الأمعاء الدقيقة، وقرصة باستخدام ملقط تشريح غرامة. سحب ببطء سنتراويفصل ل كتلة المساريقي الجهاز الليمفاوي والأمعاء الدقيقة البعيدة في اتجاهين متعاكسين حتى الأنسجة اثنين تماما عن بعضها البعض. تؤدي هذه العملية بعناية للتأكد من أن الأمعاء الدقيقة لا تمتد، وهذا يمنع من جمع استنساخه القريبة والمتوسطة والبعيدة المناطق. وضع الجهاز اللمفاوي في المساريقي 300-500 ميكرولتر PBS معقمة ووضع على الجليد. 10. باجتزاء من الجهاز الهضمي القطع الجهاز الهضمي في الأعور لفصل الأمعاء الدقيقة من القولون. ضع في القولون 300-500 ميكرولتر PBS معقمة ووضع على الجليد. جمع أنسجة تمثيلية من المناطق القريبة والمتوسطة والبعيدة من الأمعاء الدقيقة. محاذاة الأمعاء الدقيقة من نقطة المنتصف. ثم، (ط) جمع سم 2 الأخيرة من الأنسجة السابقة إلى الأعور كما الأمعاء الدقيقة البعيدة، (ب) جمع الأنسجة 5-7 سم فوق نقطة المنتصف كما الأمعاء الدقيقة الدانية، و(ج) جمع الأنسجة 3-5 سم أسفل منتصف النقطة الأمعاء الدقيقة الأوسط. 11. جمع الكبد تحديد ثلاثة فصوص من كبد الفئران بعد إزالة المعدة. سحب فصوص بعيدا عن تجويف البطن باستخدام ملقط تشريح غرامة. إزالة الكبد عن طريق قطع أي ربط أربطة باستخدام مقص غرامة. ضع في الكبد 300-500 ميكرولتر PBS معقمة ومكان على الجليد. 12. جمع الطحال تحديد الطحال. سحب الطحال بعيدا عن المعدة واستخدام مقص غرامة لقطع في الرباط المعدي. ضع في الطحال 300-500 ميكرولتر PBS معقمة ومكان على الجليد. 13. جمع الكلى تحديد الكلى التي من شأنها أن تصبح مرئية في الجزء الخلفي من تجويف البطن عند إزالة الجهاز الهضمي والأجهزة الأخرى. قطع الحالب وأي الأربطة إرفاق شالغناء مقص تشريح الدقيقة وإزالة الكلى باستخدام ملقط غرامة. إزالة الغدد الكظرية وأي مادة دهنية (إذا كان لا يزال المرفقة) باستخدام ملقط ومقص تشريح غرامة. وضع كل من الكليتين في 300-500 ميكرولتر PBS معقمة ووضع على الجليد. 14. جمع الدماغ بعد قطع الرأس، مع الاستمرار على الرأس في وضع مستقيم باستخدام ملقط منحنية. قرصة الجلد في أعلى الرأس طوليا باستخدام مجموعة أخرى من ملقط المنحنية، وإجراء شق باستخدام مقص تشريح غرامة. قطع الجلد المتبقية بالقرب من الرقبة، ومرة ​​أخرى طوليا مع مقص تشريح غرامة. سحب الجلد في اتجاه الخارج باستخدام ملقط غرامة على كلا الجانبين لتكشف الجمجمة وإزالة اللوحات الجلد باستخدام مقص تشريح غرامة. وضع مقص تشريح غرامة في فتح العمود الفقري وإجراء شق على طول الجمجمة نحو المنصة. سحب كلا الفرعين من الجمجمة في اتجاه الخارج باستخدام ملقط غرامة. قطع لإزالة أجزاء الجمجمة. <lط> إزالة المخ باستخدام ملقط واسعة، وذلك باستخدام حركة شفط صعودا من افتتاح الشوكي نحو المنصة. غسل الدماغ في برنامج تلفزيوني مرتين لإزالة أي دم من إجراء قطع الرأس. 15. معالجة الأنسجة والتجانس للتجارب التي تتطلب التهم جدوى أو استخراج الحمض النووي والأنسجة مكان في أنابيب تحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة. على الفور تحديد أعداد البكتيريا قادرة على البقاء من خلال التخفيف التسلسلي في برنامج تلفزيوني والطلاء على لوحات أجار ماكونكي، أو تخزينها في -20 درجة مئوية مع الجلسرين 20٪ للمدى القصير. لاستخراج الحمض النووي والأنسجة تخزينها في -20 درجة مئوية. للتجارب التي تتطلب استخراج الحمض النووي الريبي، والأنسجة مكان إلى كميات مناسبة من حل RNAlater (10 ميكرولتر لكل 1 ملغ الأنسجة)، ثم تخزينها على الفور في -20 درجة مئوية لفترة قصيرة أو في -80 درجة مئوية تخزين على المدى الطويل. للتجارب التي تتطلب التصوير والأنسجة مكان في 10 مل Methacarn الحل (60٪ الميثانول، و 30٪ الكلوروفورم وحمض الخليك 10٪)، ثم تخزينتي RT (20-25 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 3 أسابيع. حساب وزن الأنسجة من خلال المقارنة بين وزن الأنابيب قبل وبعد إضافة الأنسجة. تجانس الأنسجة باستخدام الخالط. غسل الخالط مرة واحدة في الايثانول 70٪ ومرتين في برنامج تلفزيوني العقيمة في تجانس بين كل عينة. ملاحظة: Methacarn تثبيت أمر مرغوب فيه لتثبيت العينات المعوية من أجل الحفاظ على هياكل الدفاع المخاطية المتعلقة الميوسين. ويمكن استخدام الفورمالين لتثبيت الأنسجة النظامية.

Representative Results

وE. القولونية K1 نموذج العدوى النظامية الموصوفة هنا يتطابق العديد من الميزات من العدوى الطبيعية في البشر. يتم بلعها البكتيريا، استعمار الجهاز الهضمي، نقل من داخل مقصورة الدم عن طريق الغدد الليمفاوية المساريقي قبل إنشاء هيئة خاصة مرض الالتهاب المرتبطة مع الدماغ 24. الأهم من ذلك، يعرض نموذج الإعالة العمرية قوية. كما هو مبين في الشكل (3)، القديمة لمدة يومين (P2) الفئران الوليدة هي عرضة للأمراض الغازية ولكن على مدى فترة سبعة أيام الحيوانات تصبح تدريجيا أكثر مقاوم للعدوى، ولكن ليس إلى الجهاز الهضمي الاستعمار (17). بعد عبور من موقع GI الاستعمار إلى المقصورة الدم والبكتيريا يمكن تصور في عينات الدم بواسطة المجهر مضان (الشكل 4) قبل الدخول إلى الجهاز العصبي المركزي في الغالب في الضفيرة المشيمية 25. في بعض الحيوانات، وهناك اجتياح واسعة من الأجهزة الرئيسية الأخرى مثلالرئة والطحال والكلى 25. أرقام البكتيرية في الأنسجة يمكن أن تختلف بشكل كبير بين الجراء الفردية 25 ولكن عندما سجل bioburden إما موجودة أو غائبة هناك درجة عالية من استنساخ فيما يتعلق الغزو الأعضاء. مع القمامة من 12 الجراء كاختبار جماعة واحدة، حسابات الطاقة باستخدام G * برامج الطاقة أن يكون هذا حجم العينة يساوي احتمال 98.6٪ من إيجاد تأثير بناء على البقاء على قيد الحياة باستخدام ستة حيوانات من الفوج و> 99٪ إذا كانت كل الاحتمالات تؤخذ بعين الاعتبار اثني عشر. هذا النموذج هو بالتالي مناسبة لتقييم وكلاء رواية المصممة خصيصا لعلاج الالتهابات البكتيرية حديثي الولادة، واستخدمت في إجراء تقييم الإمكانات العلاجية من كبسولة depolymerase EndoE التي تزيل بشكل انتقائي الكبسولة K1 من سطح البكتيريا 24-26. ويمكن أيضا أن تستخدم لتحقيق المضيفة للبكتيريا التفاعلات التي تؤثر على باتhogenesis من E. neuropathogens القولونية. ضمن هذا السياق واستخدمت لأنها دراسات E. القولونية A192PP الاستعمار ونشرها. وقد ثبت أن E. لا تزال هناك خلايا القولونية A192PP في الجهاز الهضمي من P2، P5 وP9 الجراء بأعداد كبيرة. وكانت الجوانب الزمنية للاستعمار في هذه المجموعات الثلاث متشابهة جدا (الشكل 5)، وتعكس قدرة البكتيريا لتكرار والحفاظ على الكثافة السكانية داخل القناة الهضمية. تم تعزيز الفوعة للA192 العزلة السريري من قبل مرور التسلسلي في الفئران حديثي الولادة من أجل ضمان التكرار ضئيلة أو معدومة للاستخدام الحيواني. E. استعمرت القولونية A192 P2 الفئران حديثي الولادة مع كفاءة 100٪، أثارت تجرثم الدم في 35٪ من الحيوانات وتنتج تأثير مميت في 25٪ 27. وA192PP مشتق passaged يستعمر الجهاز الهضمي، وتنتج تجرثم الدم ويسبب الفتك في جميع الجراء P2. وبالتالي، فإن النموذج يمكن أن تستخدم للتحقيق في الفوعة للديfferent K1 سلالات فيما يخص قدرتها على غزو الجهاز العصبي المركزي وأجهزة الجسم الأخرى من موقع الاستعمار. في هذا السياق، وتستخدم Pluschke وزملاء العمل 23 لحديثي الولادة نموذج إصابة الفئران لتحديد قدرة 95 E. القولونية K1 سلالات من الأصل البشري للتسبب تجرثم الدم بعد الوتر الاستعمار. لاحظوا اختلافات واسعة في كفاءة وقدرة كل من الاستعمار الغازية، التي تقوم عليها طبيعة نسيلي من E. القولونية K1 neuropathogens. الرقم 1. المواد لجمع الأنسجة: (A) على نطاق وزنها، (ب) أنابيب وزنه قبل وسائل الإعلام التي تحتوي اللازمة، (C) عملية الجدول، الحاكم والإبر تحديد ماهيتها الحيوان، (D) 70٪ (V / V) الإيثانول وبرنامج تلفزيوني لتعقيم المعدات جمع الأنسجة، <sترونج> (E) مجموعة جمع الأنسجة بما في ذلك زوج كبير من مقص لقطع الرأس ومقص وملاقط وشفرات مختلف الحجم والأشكال، (F) الثلج للحفاظ على الأنسجة، (G) 70٪ (V / V) الايثانول لتعقيم الجدول عملية والمناطق المحيطة به. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. فصل الجهاز الهضمي والجهاز اللمفاوي المساريقي. (A) قبضة كتلة مركزية من الجهاز اللمفاوي المساريقي مع ملقط تشريح غرامة. (ب) قبضة الجزء القريب من الأمعاء الدقيقة، وسحب في اتجاهين متعاكسين. (C) والجهاز الهضمي والجهاز اللمفاوي المساريقي سوف تماما separat(ه) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. بقاء الجراء الفئران حديثي الولادة الذين تتراوح أعمارهم بين يومين (P2) إلى تسعة أيام (P9) بعد تناوله عن طريق الفم من E. A192PP القولونية، مما يدل على الإعالة العمرية قوية من العدوى النظامية. وتمثل كل مجموعة 24 وليدا. الرقم 4. الصور الإسفار من E. وكان مستضد عديد السكاريد الشحمي يا على سطح خلايا البكتيريا القولونية A192PP في مسحة الدم من الجرو P2 المصابة بعد تناوله عن طريق الفم من البكتيريا. الحادي وained مع أرنب الأجسام المضادة بولكلونل مكافحة O18 وAlexa546 مترافق الماعز المضادة للأرنب الضد الثاني. وقد تصور الكبسولة K1 مع EndoE-GFP كاشف. تقريبا كل البكتيريا المكتشفة في عينات الدم عرضها في K1 كبسولة واقية. كانت الصور الملتقطة بواسطة الدكتور أندريا Zelmer. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5. E. تم استخراج كولاي المعوية A192PP الاستعمار الإدارة التالية من اللقاح البكتيري. DNA من الأمعاء كله وE. القولونية K1 مستعمرة / غرام (كفو / ز) الأنسجة التي يحددها الكمي تفاعل البلمرة المتسلسل (QPCR) استهداف polysialyltransferase (neuS) الجين كما وصفت في أماكن أخرى 17 </suP>. اللد: الحد من الكشف. ميزة صحي معتل لون البشرة وردي شاحب / أصفر خفة الحركة (المنعكس المقوم) الجرو عكس فورا على وضع متخلف صعوبة في عكس وضع متخلف (> 3 ثانية) أو لا يمكن تحقيق ضغط لطيف على البطن أي صوت صوت التحريض المعدة / خط الحليب مرئية والأبيض غير مرئية درجة الحرارة دافئ باردا نسبيا * الوزن كسب 1.5-2 غرام يوميا لا زيادة الوزن أو فقدان الوزن السلوك عند وضعه في قفص خطوات نحو الأم ويبدأ وeeding لا يمكن أن تتحرك نحو الأم ومعارض التغذية صعوبة الجدول 1. سبع نقاط نظام التسجيل: الدرجات الثلاث الأولى المدرجة وعادة ما تكون العلامات الأولية المرصودة. * حديثي الولادة مع الإصابة الجهازية تجربة رفع درجة حرارة الجسم (> 2 درجة مئوية). ولكن نظرا لعدم وجود رشاقة من الحيوانات للوصول إلى والدتهما للحفاظ على درجة حرارة الجسم، قد تصبح الحيوانات غير صحية فصلها عن القمامة وتشعر بالبرد في اليد العارية.

Discussion

نموذج الحيوان الموصوفة هنا يبني على الأعمال السابقة التي تهدف لإعادة إنتاج السمات البارزة من الالتهابات التي تحدث بشكل طبيعي في البشر. كانوا يعملون الفئران حديثي الولادة في البداية لدراسة التهاب السحايا الرضع بسبب H. النزلية نوع (ب) كما اقتنعت الأنواع المعايير الرئيسية لنموذج قوي للعدوى. وبالتالي، يجب على بوابة دخول العوامل المسببة للأمراض ذات الصلة التي تعكس من العدوى البشرية الطبيعي وتعطي بتكاثر ترتفع إلى أمراض مماثلة لفترة كافية للسماح للتدخل العلاجي. التقنيات المستخدمة يجب أن لا تحد من إمكانية تطبيق هذا الإجراء ويجب أن لا تساهم في نتائج المرض 20. نموذج H. النزلية التهاب السحايا في الفئران الرضع التي وضعتها Moxon وزملاؤه يلبي هذه المعايير 20؛ تحدث العدوى الطبيعي بعد تكرار الاستعمار في الأغشية المخاطية في الجهاز التنفسي العلوي وهذه ميزة مهمة في الفئران الوليدة من غير الصدمةتقطير التشنج من البكتيريا على أغشية الممرات الأنفية. الأهم من ذلك، وتكرر الطبيعة تعتمد على عمر العدوى في النموذج.

وكانت نفس المجموعة أيضا أول من وضع نموذجا غير الغازية من E. القولونية K1 NBM في الفئران حديثي الولادة 22. كانت مستعمرة خالية من العوامل الممرضة الجراء سبراج داولي عن طريق تغذية 10 أغسطس – 10 أكتوبر البكتيريا عن طريق أنبوب المعدة عن طريق الفم. كان اللقاح بالتالي أعلى بكثير من تلك المستخدمة من قبلنا. استعمار مع سلالات K1 ثلاثة فحصت، C94 حدث، في نسبة كبيرة نسبيا (48-74٪) من (O7: K1: H-)، EC3 (O1: K1: H-) وLH (H3 O75: K1) الحيوانات K1 التي تغذيها، ولكن حالات تجرثم الدم والتهاب السحايا وفيات متغير وأقل بكثير من معدلات الاستعمار. طبيعة نسيلي من E. تأسست العدوى التجريبية القولونية K1 بعد 23 ومن الواضح الآن أن O18 فقط: K1، وإلى حد أقل، O7: الأنماط المصلية K1 قادرةأن تسبب عدوى باستمرار النظامية. لهذا السبب، فإن هذه التحقيقات من التسبب في ممرض للأعصاب E. واستندت القولونية K1 على استخدام محسنة الفوعة O18: K1 سلالة A192PP. مقارنة بين E. التغذية القولونية K1 من الفئران حديثي الولادة عن طريق أنبوب المعدة، كما يستخدمه Glode وزملاؤه 22، وطريقة التغذية قطرة كما تستخدمها مجموعة Achtman في 23 كشفت أرقام كبيرة من الوفيات باستخدام الأسلوب السابق، يكاد يكون من المؤكد بسبب الأضرار التي لحقت المخاطية السطوح من قبل أنبوب المعدة. كما نسب الاستعمار قابلة للمقارنة مع هاتين الطريقتين، فمن المستحسن استخدام الأسلوب أقل الغازية لتغذية البكتيريا باستخدام ماصة مع طرف عقيمة، كما هو موضح في هذه الاتصالات.

كولاي سلالة A192PP المستخدمة في دراساتنا هو O18: K1. وهو مشتق أكثر ضراوة من سلالة السريري E. القولونية A192 التي تم استرداد الأصل من المريض مع تسمم الدم 27 </سوب>. تم الحصول على زيادة الفوعة من سلالة قبل مرور تسلسلي من خلال الفئران حديثي الولادة 26. سلالة يثير لشدة المرض تعتمد على السن، مع 100٪ تجرثم الدم وفيات عندما تدار ل2 يوم 28 الحيوانات القديمة. في المقابل، الحيوانات القديمة يوم 9 مقاومة تماما للمرض. يمكن استخدام K1 محددة الجراثيم التحللي للتمييز E. القولونية E. K1 من الآخرين سلالات القولونية 29. في هذه الدراسة، يجب أن تستخدم حساسية البكتيريا قادرة على البقاء لK1E عاثية إلى (ط) تحقق نقاء E. تعليق القولونية K1 أعدت لتغذية الحيوانات، و (ii) للتمييز E. القولونية K1 من القولونيات أخرى لاحتساب الجدوى في مسحات حول الشرج، والدم وعينات الأنسجة. إذا كانت مستعمرة هي E. القولونية K1، فإنه سيكون عرضة للعاثية K1E تحلل، وسيتم تثبيط نمو البكتيريا في موقع التلقيح عاثية. إذا كانت مستعمرة ليست E. القولونية K1، سيكون بمقاومة للتحلل KIE عاثية البريد، ويجب أن تكون هناك مساحة للنمو البكتيري في موقع التلقيح عاثية. وينبغي أن يوضع في الاعتبار أن النماذج الحيوانية لا يمكن أن تعكس كل مظاهر المرض تحدث بشكل طبيعي. يمكن تعديل النموذج الحالي لدراسة خصائص الفوعة البكتيريا ممرض للأعصاب أخرى من E. يمكن استيعاب القولونية A192PP والاختلافات في حجم اللقاح استعمار. ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية لتقنية تقييم الأدوية التي تشتد الحاجة إليها لعلاج حالة وللكشف عن تفاصيل استجابة المضيف للاستعمار وغزو الأنسجة.

الطريقة الموصوفة هنا هو بسيطة لكنها فعالة. تم توظيف 12 الجراء مثل اختبار أو سيطرة الجماعات وهذا النهج داخل القمامة يضمن درجة عالية من التكاثر وصحة الإحصائية – الفضلات واحدة من 10. لا بد من أن يتم إرجاع الجراء لأمهاتهم الطبيعية في أقرب وقت ممكن بعد أي الاجراءلذا لا ينبغي أن تشمل البريد والفضلات الحيوانات تمر التدخلات المختلفة. من المهم أن اللقاح بتغذية أن تكون درجة حرارة وإلا فإن الجراء سيرفض الثقافة المقدمة. الجراء تتطور بسرعة والجراثيم معقدة وخلال يومين من الولادة واستعمرت الجهاز الهضمي مع مجموعة واسعة من البكتيريا من الكائنات الحية من تأسيس مثل الميكروبات الأكثر وفرة في الرضع والبالغين الأمعاء. الجراء التي لم يتم تغذيتها E. القولونية A192PP لا تحمل E. K1 القولونية في الجهاز الهضمي 17 وحتى تحديد معدلات الاستعمار هو بسيط نسبيا. ومع ذلك، المستندة على neuS QPCR طريقة للكشف عن استعمار E. القولونية K1 هو أبعد ما يكون أكثر حساسية أن أساليب الثقافة التقليدية ويوصى بقوة 17.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل عن طريق المنح البحثية G0400268 وMR / K018396 / 1 من مجلس البحوث الطبية، وعمل أبحاث الطبية. وقدمت المزيد من الدعم من قبل المعهد الوطني للكلية لندن المستشفيات مركز البحوث الطبية الحيوية بجامعة بحوث الصحية.

Materials

Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) Harlan, UK www.harlan.com
E. coli K1 A192PP Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Glycerol  Sigma, UK www.sigmaaldrich.com G5516
Mueller-Hinton Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0337
Mueller-Hinton Broth Oxoid, UK www.oxoid.com CM0405
MacConkey Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0007
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P4417
Ethanol 100% Sigma, UK www.sigmaaldrich.com E7023
Heparin Sodium Salt Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 84020
Prepare 20-50 units/ml
RNAlater Solution Sigma, UK www.sigmaaldrich.com R0901
10µl/mg tissue
Acetic Acid Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 320099
Chloroform Sigma, UK www.sigmaaldrich.com C2432
Methanol Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 322415
Cotton-tipped swabs Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 11542483
Alcotip Swabs Scientific Laboratory Supplies, UK www.scientificlabs.co.uk SWA1000
Petri dishes Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P5856
30mL Universal Tube AlphaLaboratories, UK www.alphalabs.co.uk CW3890
0.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1405-1500
1.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1415-1000
0.1µl calibrated loops StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-0112
L-shaped spreaders StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-1005
Cuvettes Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 10594175
Forceps straight with fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12780036
Forceps straight with blunt tips Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points  Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12740926
Scissors straight with very fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12972055
Laboratory Scissors VWR, UK www.vwr.com USBE4251
25g Syringe Needles Greiner Bio-One Ltd www.greinerbioone.com N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers PerkinElmer, UK www.perkinelmer.co.uk L60000BB
Unitemp Incubator B&T, UK OP958
Multitron shaking incubator INFORS HT, UK www.infors-ht.com AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer IKA Werke www.ika.com 0003737000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity. 23 (5), 218-225 (1999).
  2. Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).
  3. Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queirós, F., Nova, C. V., Lucena, R. Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil. J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).
  4. Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
  5. Robbins, J. B., et al., Med, ., et al. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. N. Eng. J. 290 (22), 1216-1220 (1974).
  6. Korhonen, T. K., et al. hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis. Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).
  7. Rutishauser, U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).
  8. Koedel, U., Pfister, H. W. Models of experimental bacterial meningitis. Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).
  9. Tunkel, A. R., Scheld, W. M. Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits. Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).
  10. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).
  11. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).
  12. Sarff, L. D., et al. Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns. Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).
  13. Schiffer, M. S., et al. A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli. Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).
  14. Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).
  15. Nassif, X., Bourdoulous, S., Eugène, E., Couraud, P. O. How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier. Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).
  16. Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. The infant rat as a model of bacterial meningitis. J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).
  17. Birchenough, G. M. H., et al. Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).
  18. Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).
  19. Bevins, C. L., Salzman, N. H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).
  20. Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation. J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).
  21. Bortolussi, R., Ferrieri, P., Björkstén, B., Quie, P. G. Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis. Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).
  22. Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1. Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).
  23. Pluschke, G., Mercer, A., Kusećek, B., Pohl, A., Achtman, M. Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types. Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).
  24. Zelmer, A., et al. Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1. Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).
  25. Zelmer, A., et al. Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1. Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).
  26. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).
  27. Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
  28. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).
  29. Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).

Tags

Neuropathogenic Escherichia ColiNeonatal RatNon-invasive Infection ModelGut-lymph-blood-brain InfectionAge-dependent InfectionE. Coli O18:K1VirulenceMeningeal InvasionCentral Nervous System InfectionPathogenesisTherapeutic InterventionsBacterial Virulence

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M. H., Taylor, P. W. Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat. J. Vis. Exp. (92), e52018, doi:10.3791/52018 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image