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Imunologia e Infecção

Modelo no invasiva de neuropatogénico<em> Escherichia coli</em> La infección en Neonatología Rata

Published: October 29, 2014
doi:
10.3791/52018
, , , ,
1School of Pharmacy,University College London, 2Mucin Biology Group,University of Gothenburg

Summary

Aquí, se describe un procedimiento para el establecimiento de la infección sistémica en la rata neonatal con cultivos de Escherichia coli K1. Este procedimiento no invasivo permite la colonización del tracto gastrointestinal, la translocación del patógeno a la circulación sistémica, y la invasión del sistema nervioso central en el plexo coroideo.

Abstract

La investigación de las interacciones entre huésped animal y patógeno bacteriano sólo tiene sentido si el modelo de infección empleada replica las principales características de la infección natural. Este protocolo describe los procedimientos para el establecimiento y la evaluación de la infección sistémica debido a neuropatogénico K1 Escherichia coli en la rata neonatal. La colonización del tracto gastrointestinal conduce a la difusión del patógeno a lo largo del curso de gut-linfático-sangre-cerebro de la infección y el modelo muestra una fuerte dependencia de la edad. Una cepa de E. coli O18: K1 con la virulencia mejorada para la rata neonatal produce excepcionalmente altas tasas de colonización, la translocación al compartimento de la sangre y la invasión de las meninges siguiente tránsito por el plexo coroideo. Como en el huésped humano, la penetración del sistema nervioso central se acompaña de inflamación local y un resultado invariablemente letal. El modelo es de probada utilidad para el estudio de los mecanismosde la patogénesis, para la evaluación de las intervenciones terapéuticas y para la evaluación de la virulencia bacteriana.

Introduction

Infecciones bacterianas sistémicas son una gran amenaza para el bienestar y la supervivencia del recién nacido; los bebés prematuros son especialmente vulnerables. La meningitis bacteriana neonatal (NBM), frecuentemente asociada a la sepsis bacteriana, sigue siendo una fuente importante de mortalidad y morbilidad durante las primeras semanas de vida y el problema se ve agravado por la continua evolución de la resistencia a los fármacos antibacterianos de primera línea de 1,2. Un caso de NBM es una emergencia médica que lleva a una alta carga médica, social y económica 3; en consecuencia, hay una necesidad urgente de nuevos agentes terapéuticos y, en particular, nuevas estrategias profilácticas para reducir la carga de la infección. Algunas características de NBM son inusuales: en el mundo desarrollado, Escherichia coli y estreptococos del grupo B son responsables de la gran mayoría de los casos y la capacidad de estas cepas para obtener NBM está casi siempre asociada con la presencia de un polisacárido ca protectorapsule que permite al patógeno para evadir el reconocimiento inmune procesa 4. Una proporción muy elevada (80-85%) de neuroinvasiva E. coli exprese la cápsula K1 5,6, un polímero de ácido polisiálico ligada α-2,8 que es estructuralmente idéntico al anfitrión de moduladores de la plasticidad neuronal 7.

La evaluación de nuevos productos terapéuticos y profilácticos para NBM y bacteriemia asociada y la sepsis se beneficiaría claramente de un modelo animal robusto de la infección que imita las características clave de la enfermedad en el recién nacido humano, en particular, la fuerte dependencia de la edad y de la vía natural de infección . Una amplia gama de modelos para la meningitis bacterianas Gram-positivas y Gram-negativas están disponibles 8,9 y estos tienen amplió considerablemente nuestro conocimiento de las opciones patogenia, fisiopatología y el tratamiento de estas infecciones. Por lo tanto, las infecciones experimentales en ratas, ratones, conejos y monos se han utilizado para estudiar la meningitis en tanto el neonate y el adulto. Sin embargo, muchos de estos modelos emplean la inyección intracisternal o subcutánea directa de bacterias para la iniciación de la infección, la creación de un patogénesis artificial sin pasar por procesos naturales de difusión desde el sitio de la colonización. En algunos casos estos métodos de inoculación condujeron a cambios significativos en la patología; por ejemplo, la administración subcutánea de E. cepas de coli K1 abrogadas la dependencia de la edad asociada con la infección natural, la producción de bacteriemia y la invasión del sistema nervioso central (SNC) tanto en recién nacidos y adultos 10. Predisposición a E. coli NBM es críticamente dependiente de la transmisión vertical del agente causal de la madre al bebé durante o poco después del nacimiento 11. Maternalmente derivado de E. bacterias coli K1 colonizan el tracto gastrointestinal neonatal 11-13 (GI), que es estéril al nacer, pero rápidamente adquiere una microbiota compleja 14. En los recién nacidos colonizados, E. coliK1 bacterias tienen la capacidad de trasladar desde la luz intestinal hacia la circulación sistémica antes de entrar en el SNC a través de la sangre-cerebro o barreras sangre-líquido cefalorraquídeo 9,15. El diseño de modelos sólidos de infección experimental debería tomar estos datos en cuenta.

Aunque los ratones han sido ampliamente utilizados para el estudio de algunas formas de meningitis bacteriana 8, que no son adecuados para el estudio de la infección neonatal: están abrumados por la infección sistémica y no muestran la fuerte dependencia de la edad característica de los bebés humanos 16. Además, α-defensinas, péptidos clave del tracto GI proporcionar protección contra la invasión sistémica por E. coli K1 17, son altamente expresado en las células de Paneth y neutrófilos en seres humanos y ratas, pero no en ratones 18. Hay un notable grado de duplicación, la redundancia y la heterogeneidad en defensinas ratón y los genes relacionados cryptidin no se encuentra en otro unimals 19. La rata neonatal fue utilizado inicialmente por Moxon y compañeros de trabajo de 20 a investigar la patogenia de la meningitis por Haemophilus influenzae después de la inoculación intranasal, replicando el sitio natural de la colonización de este patógeno neonatal en el ser humano, y posteriormente adaptado para la edad dependiente E. coli K1 bacteriemia y meningitis. Bortolussi et al. 21 inyección intraperitoneal empleada del inóculo bacteriano para iniciar la infección, pero el estudio clave de Glode y compañeros de trabajo el 22 de alimentación gástrica oral utilizado en paralelo la vía natural de infección después de la colonización gastrointestinal. A medida que el tubo gástrico puede dañar las superficies mucosas, el procedimiento se perfeccionó para incluir la alimentación del inóculo a los recién nacidos 23. Aquí, el método para GI colonización y procedimientos para el seguimiento de la infección en crías de ratas susceptibles se describen tracto; Adicionalmente, se discuten las aplicaciones terapéuticas y preventivas del modelo.

Protocol

Todos los experimentos con animales llevados a cabo en este estudio se ajustaban a la legislación nacional y europea y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Farmacia de la UCL y el Ministerio del Interior británico (HO). Todo el trabajo de los animales se llevó a cabo bajo el proyecto HO licencias PPL, 80/2243 y 70/7773 PPL. 1. Preparación de la rata Llevar a cabo todos los experimentos in vivo utilizando ratas Wistar neonatales libres de patógenos. Conserve todas las crías de rata (12 neonatos por colonia) en jaulas individuales con sus madres lactantes (9-11 semanas de edad las hembras), en condiciones óptimas (19-21 ° C, 45 – 55% de humedad, 15 a 20 cambios de aire / hora y 12 horas de luz / oscuridad ciclo). 2. Preparación de la célula bacteriana Tienda E. stocks coli K1 en 20% (v / v) de glicerol a -80 ° C. Para cada experimento, la placa de las bacterias de valores Onto Mueller-Hinton (MH) placas de agar, y se incuba a 37 ° CO / N. El día antes de la alimentación, inofinales de los 10 ml de caldo de MH con un solo E. coli K1 colonia y cultivo O / N a 37 ° C, 200 rpm. Como control para la contaminación medio, preparar 10 ml de caldo MH sin inocular e incubar a 37 ° C a 200 rpm. Transferir 100 l de suspensión O N / bacteriana en 9,9 ml de caldo MH (1: 100 v / v), y se incuba a 37 ° C, 200 rpm, hasta que se alcanza exponencial media de fase, correspondiente a una densidad óptica de 0,6 medido a una longitud de onda de 600 nm (OD 600). 3. La alimentación de ratas recién nacidas con E. coli K1 Aplique suavemente el animal en posición vertical en un lado de la piel del cuello, permitiendo que la boca se abra. Lentamente inserte la punta de pipeta estéril en la boca del animal, y la pipeta 20 l del inóculo (~ 37 ° C) en la boca del animal durante un período de tiempo de 30 seg. Volver al animal a su madre inmediatamente después de la alimentación. Verifique que 4-8 x 10 6 bacterias han sido alimentados to cada cachorro por dilución en serie del inóculo en PBS y manchado en placas de agar MH. 4. Evaluación de la colonización por E. coli K1 Aplique suavemente al animal en una parte de la piel del cuello. Humedezca un hisopo con punta de algodón estéril en PBS estéril, y luego limpie suavemente el área perianal. Volver al animal a su madre inmediatamente después limpiando. Coloque la punta del hisopo en un tubo que contiene 300 l de PBS estéril y almacenar en hielo. Determinar el número de bacterias viables por dilución en serie en PBS y enchapado en placas de agar MacConkey. Determinar viable E. coli K1 por las pruebas de sensibilidad bacteriófago. Escoja una colonia individual utilizando un bucle microbiológica estéril, se sumerge en 200 l de PBS estéril, a continuación, con sujeción a un mezclador vortex. Utilizando un asa microbiológica estéril, sub-cultivo en agar MH en una línea recta. Deje que la placa se seque durante 30 segundos, y luego pipeta de 10 l de bacK1E teriophage (10 9 unidades formadoras de placa / ml (PFU / ml)) en el centro de la línea. Incubar la placa de O / N a 37 ° C. Al día siguiente, examine la placa para la lisis mediada por bacteriófago. 5. Evaluación de la gravedad de la enfermedad Evaluar la gravedad de la enfermedad de cada animal 4 – 5 veces al día usando el sistema de calificación de siete puntos se indica en la Tabla 1. Si un puntajes animales ≥3 de 7, sacrificar inmediatamente al animal para minimizar el sufrimiento. Registre el animal muerto. 6. eutanasia de ratas recién nacidas y de extracción de sangre Aplique suavemente el animal en una mano, dejando al descubierto la cabeza y el cuello. Desinfectar el cuello del animal frotando con un algodón con alcohol. Desinfectar un gran par de tijeras que utilizan etanol al 70%, antes de enjuagar en PBS estéril para eliminar el etanol rastro. Aplique suavemente el animal directamente sobre una placa de Petri. Decapitar al neonato mediante surgi agudotijeras cal, lo que garantiza que la sangre gotea en la placa de Petri. Evitar el contacto con la cabeza para evitar la contaminación de la sangre con flora de la piel. Inmediatamente recoger la sangre con una pipeta estéril y mezclar con la sal de sodio de heparina a una concentración de 20 – 50 unidades / ml en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Determinar el número de bacterias viables por dilución en serie en PBS y enchapado en placas de agar MacConkey. Determinar el número de E. viable coli K1 mediante pruebas de la susceptibilidad de las bacterias viables para K1E bacteriófago. 7. Disección Después de la decapitación de la rata neonatal, utilice condiciones asépticas para escindir y recoger tejidos de interés. Lavar todos los instrumentos (que se muestran en la Figura 1) en etanol al 70% y PBS estéril. Limpie la junta disección y mojar el abdomen completamente con etanol al 70%. Coloque el cadáver en su parte posterior y fijar a la placa de disección por (i) fijar la pata trasera izquierda ala mesa de operaciones con una aguja estéril, (ii) estirar el cadáver y la fijación de la pata delantera derecha a la mesa de operación, (iii) fijar la pata trasera derecha y la pata delantera izquierda a la mesa de operación. Tire de la piel a lo largo del lado izquierdo de la parte inferior del abdomen utilizando fórceps, luego se corta a lo largo del lado izquierdo del cadáver desde la parte inferior del abdomen al esternón mediante pequeñas tijeras de disección. Extienda la extirpación a través del esternón, y luego hacia abajo a la derecha del cadáver desde el esternón hasta el bajo vientre utilizando pinzas y pequeñas tijeras de disección, lo que garantiza que ninguna de las estructuras subyacentes están dañados. Por último, tire suavemente hacia abajo el colgajo de piel desde el esternón hasta el bajo vientre usando iris pinzas de disección curvas para exponer el peritoneo. Elevar suavemente el peritoneo con una pinza y corte vertical para exponer los órganos internos, asegurando que ninguno de los órganos subyacentes están dañados. 8. Recolecciónel tracto gastrointestinal Identificar el estómago, intestino delgado, ciego, colon y sistema linfático mesentérico. Retire el estómago por transección suavemente a cada lado, entonces coloque en un bijou que contiene 1,6 ml de PBS estéril usando fórceps estériles. Seccionar el colon en el recto. Tire con cuidado toda la masa intestinal del cadáver utilizando pinzas de disección y colocar en un plato de Petri estéril. Asegúrese de que esto se hace con cuidado para que la estructura intestinal y estructuras linfáticas mesentéricas no se separan. 9. Separación del tracto gastrointestinal y el sistema linfático mesentérico (Figura 2) Verter 30 ml de PBS estéril en la placa de Petri, asegurando el tracto GI está completamente sumergido. Identificar la masa central del sistema linfático mesentérico, y pellizcar utilizando pinzas de disección finas. Identificar la parte más proximal del intestino delgado, y pellizcar el uso de fórceps de disección finas. Tire lentamente del Central masa de sistema linfático mesentérico y el intestino delgado distal en direcciones opuestas hasta que los dos tejidos están completamente separadas una de la otra. Realizar este proceso con cuidado para asegurarse de que el intestino delgado no se estiran, ya que esto evita la colección reproducible de proximal, medio y distal regiones. Coloque el sistema linfático mesentérico en 300-500 l de PBS estéril y colocar en hielo. 10. La sección del tracto gastrointestinal Seccionar el tracto GI en el ciego para separar el intestino delgado desde el colon. Coloque los dos puntos en 300-500 l de PBS estéril y colocar en hielo. Recoger los tejidos representativos de las regiones proximales, intermedias y distales del intestino delgado. Alinear el intestino delgado desde el punto medio. Entonces, (i) recoger los últimos 2 cm de tejido antes de la ciego como el intestino delgado distal, (ii) recoger el tejido 5-7 cm por encima del punto medio como el intestino delgado proximal, y(Iii) recoger el tejido de 3 – 5 cm por debajo del punto medio como el intestino delgado medio. 11. Recogida de Hígado Identificar los tres lóbulos del hígado de la rata después de la eliminación del estómago. Tire lóbulos lejos de la cavidad abdominal utilizando pinzas de disección finas. Retire el hígado mediante la reducción de los ligamentos que sujetan con unas tijeras finas. Coloque hígado en 300-500 l de PBS estéril y el lugar en el hielo. 12. Recogida del Bazo Identificar el bazo. Tire de bazo de distancia desde el estómago y el uso de tijeras finas para cortar el ligamento gastroesplénico. Coloque el bazo en 300-500 l de PBS estéril y colocar en hielo. 13. Recopilación de los Riñones Identificar los riñones que se harán visibles en la parte posterior de la cavidad abdominal después de la retirada del tracto gastrointestinal y otros órganos. Uréteres Cut y cualquier ligamentos que unen ucantar tijeras de disección finas y eliminar riñones utilizando unas pinzas finas. Retire las glándulas suprarrenales y cualquier material graso (si todavía unido) usando pinzas finas y tijeras de disección. Coloque ambos riñones en 300-500 l de PBS estéril y colocar en hielo. 14. Recogida del cerebro Después de la decapitación, mantenga la cabeza en posición vertical utilizando pinzas curvas. Apriete la piel en la parte superior de la cabeza longitudinalmente utilizando otro conjunto de pinzas curvas, y hacer una incisión con tijeras de disección finas. Cortar la piel que queda cerca del cuello, de nuevo longitudinalmente con tijeras de disección finas. Tire de la piel en una dirección hacia el exterior utilizando unas pinzas finas en ambos lados para revelar el cráneo y extraer colgajos de piel con unas tijeras de disección finas. Coloque las tijeras de disección finas en la apertura de la columna vertebral y hacer una incisión a lo largo del cráneo hacia la tribuna. Tire de las dos secciones del cráneo en una dirección hacia el exterior utilizando unas pinzas finas. Cortar para eliminar segmentos del cráneo. <li> Eliminar cerebro utilizando pinzas anchas, usando un movimiento hacia arriba recogiendo desde la apertura de la médula hacia la tribuna. Lavar el cerebro en PBS dos veces para eliminar cualquier sangre de procedimiento de la decapitación. 15. Procesamiento de tejido y homogeneización Para los experimentos que requieren recuentos de viabilidad o la extracción de ADN, tejidos lugar en tubos que contenían PBS estéril. Inmediatamente determinar el número de bacterias viables por dilución en serie en PBS y enchapado en placas de agar MacConkey, o almacenar a -20 ° C con 20% de glicerol para corto plazo. Para la extracción de ADN, tejidos almacenar a -20 ° C. Para los experimentos que requieren la extracción de RNA, lugar tejidos en volúmenes apropiados de solución RNAlater (10 l por cada 1 mg de tejido), a continuación, guarde inmediatamente a -20 ° C para el corto plazo o a -80 ° C de almacenamiento a largo plazo. Para los experimentos de formación de imágenes, los tejidos que requieren lugar en solución 10 ml methacarn (60% de metanol, 30% de cloroformo y ácido acético al 10%), a continuación, almacenar unat RT (20 – 25 ° C) durante un máximo de 3 semanas. Calcular el peso del tejido por comparación de peso de los tubos antes y después de la adición de los tejidos. Homogeneizar los tejidos utilizando un homogeneizador. Lavar el homogeneizador una vez en etanol al 70% y dos veces en PBS estéril entre la homogeneización de cada muestra. NOTA: la fijación methacarn es deseable para la fijación de las muestras intestinales a fin de preservar las estructuras de defensa de la mucosa relacionada con mucina; la fijación con formalina se puede utilizar para los tejidos sistémicos.

Representative Results

El E. coli K1 modelo de infección sistémica se describe aquí se replica muchas de las características de la infección natural en los seres humanos. Las bacterias se ingieren, colonizar el tracto GI, trasladar en el compartimiento de sangre a través de los ganglios linfáticos mesentéricos antes de establecer la enfermedad específica de órgano con la inflamación del cerebro asociada 24. Es importante destacar que el modelo muestra una fuerte dependencia de la edad; como se muestra en la Figura 3, de dos días de edad (P2) crías de rata son altamente susceptibles a la enfermedad invasiva, pero durante un período de siete días los animales se vuelven progresivamente más refractario a la infección, pero no para la colonización del tracto GI 17. Después de tránsito desde el lugar de GI colonización al compartimento de sangre, las bacterias pueden ser visualizados en muestras de sangre por microscopía de fluorescencia (Figura 4) antes de entrar en el SNC predominantemente en el plexo coroideo 25. En algunos animales, hay una extensa invasión de otros órganos principales, tales comopulmón, bazo y riñón 25. El número de bacterias en los tejidos pueden variar sustancialmente entre crías individuales 25, pero cuando la carga biológica se anotó como presente o ausente existe un alto grado de reproducibilidad con respecto a la invasión de órganos. Con una camada de 12 cachorros como una única cohorte de prueba, cálculos de potencia utilizando G Software * Potencia determinaron que este tamaño de la muestra equivale a un 98.6% de probabilidad de encontrar un efecto sobre la base de la supervivencia usando seis animales de la cohorte y> 99% de probabilidad si todo doce son tomados en consideración. El modelo es por lo tanto adecuado para la evaluación de nuevos agentes específicamente adaptados para el tratamiento de infecciones bacterianas neonatales y se ha utilizado en el procedimiento para evaluar el potencial terapéutico de la cápsula despolimerasa EndoE que elimina selectivamente la cápsula K1 de la superficie bacteriana 24-26. También se puede utilizar para investigar las interacciones huésped-bacteria que inciden en la pathogenesis de E. neuropathogens coli; dentro de este contexto, se ha empleado para los estudios de E. coli A192PP colonización y diseminación. Se ha demostrado que la E. células coli A192PP persisten en el tracto GI de P2, P5 y P9 cachorros en grandes números; aspectos temporales de la colonización en estos tres grupos fueron muy similares (Figura 5) y refleja la capacidad de las bacterias de replicar y mantener la densidad de población en el intestino. La virulencia de la cepa clínica A192 fue realzada por paso en serie en ratas neonatales con el fin de asegurar poca o ninguna redundancia del uso de animales. E. coli A192 colonizada P2 ratas neonatales con una eficiencia del 100%, provocó la bacteriemia en el 35% de los animales y produjo un efecto letal en el 25% 27. El A192PP derivado passaged coloniza el tracto GI, produce bacteriemia y causa letalidad en todos los cachorros P2. Así, el modelo se puede emplear para investigar la virulencia de diferentes cepas K1 con respecto a su capacidad para invadir el SNC otros sistemas de órganos y desde el sitio de la colonización. En este contexto, Pluschke y compañeros de trabajo 23 utilizaron un modelo de infección neonatal de rata para determinar la capacidad de 95 E. coli K1 cepas de origen humano para causar bacteremia después de la colonización del intestino; observaron grandes variaciones en la eficiencia de tanto la colonización y la capacidad invasiva, que sustenta la naturaleza clonal de E. coli K1 neuropathogens. Figura 1. Materiales para la recogida de tejidos: (A) balanza, (B) tubos previamente pesados ​​que contienen los medios necesarios, (C) operación mesa, regla y agujas de precisar el animal, (D) 70% (v / v) etanol y PBS para esterilizar el equipo de recogida de tejidos, <strong> (E) kit de recogida de tejido incluyendo un gran par de tijeras para decapitación y tijeras y pinzas y cuchillas de diversos tamaños y formas, (F) de hielo para preservar los tejidos, (G) 70% (v / v) de etanol para la esterilización la mesa de operaciones y sus alrededores. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. Figura 2. Separación del tracto GI y el sistema linfático mesentérico. (A) Agarre la masa central del sistema linfático mesentérico con unas pinzas de disección finas. (B) Sujete la parte proximal del intestino delgado, y tirar en direcciones opuestas. (C) El tracto gastrointestinal y el sistema linfático mesentérico hará plenamente separate. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. Figura 3. La supervivencia de las crías de rata neonatal de entre dos días (P2) a nueve días (P9) después de la administración oral de E. coli A192PP, que ilustra la fuerte dependencia de la edad de la infección sistémica. Cada grupo representa a 24 recién nacidos. Figura 4. Las imágenes de fluorescencia de E. células coli A192PP en un frotis de sangre de un cachorro infectado; P2 después de la administración oral de bacterias. El antígeno O del lipopolisacárido en la superficie bacteriana era stobjetivó con conejo anti-O18 anticuerpo policlonal y de cabra anti-conejo conjugado con Alexa546 segundo anticuerpo. La cápsula K1 se visualizó con el reactivo EndoE-GFP. Prácticamente todas las bacterias detectadas en muestras de sangre muestran la cápsula protectora K1. Las imágenes fueron capturadas por el Dr. Andrea Zelmer. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. Figura 5. E. coli A192PP colonización intestinal tras la administración del inóculo bacteriano de ADN. Se extrajo el conjunto delgado y E. coli K1 unidades formadoras de colonias / g (CFU / g) de tejido determinada por la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) la orientación del gen polysialyltransferase (Neus) como se describe en otra parte 17 </sup>. LD: límite de detección. Característica Saludable Insalubre El color de la piel Rosa Pale / Amarillo Agilidad (reflejo de enderezamiento) Pup invierte inmediatamente en la colocación hacia atrás Dificultad en la reversión de la colocación hacia atrás (> 3 s) o no se puede lograr Una suave presión sobre el abdomen No hay sonido Sonido de agitación Estómago / línea de leche Visible y blanco No visible Temperatura Cálido Relativamente frío * Peso Ganancia de 1,5 a 2 g por día Sin aumento de peso o pérdida de peso Comportamiento cuando se coloca en la jaula Se mueve hacia la madre y comienza feeding No se puede mover hacia la madre y muestra dificultad para la alimentación Tabla 1. Siete-punto sistema de puntuación: Los tres primeros resultados de la siguiente lista son por lo general los signos iniciales observados. * Los recién nacidos con infección sistémica experiencia elevada temperatura corporal (> 2 ° C). Sin embargo, debido a la falta de agilidad de los animales para llegar a su madre a mantener la temperatura corporal, los animales no saludables pueden separarse de la zona de arena y sentir frío a la mano desnuda.

Discussion

El modelo animal descrito aquí se basa en el trabajo previo que tuvo como objetivo reproducir las características más destacadas de las infecciones de origen natural en los seres humanos. Ratas neonatales fueron empleados inicialmente para estudiar la meningitis infantiles debidas a H. influenzae tipo b como la especie cumplía los criterios clave para un modelo robusto de la infección. Por lo tanto, la puerta de entrada del agente patógeno debe reflejar la de la infección humana natural y reproducible dan lugar a patología similar de duración suficiente para permitir la intervención terapéutica. Las técnicas utilizadas no debe limitar la aplicabilidad del procedimiento y no deben contribuir a la evolución de la enfermedad 20. El modelo de H. influenzae meningitis en ratas infantiles desarrolladas por Moxon y sus colegas satisface estos criterios de 20; la infección natural se produce después de la colonización de las membranas mucosas del tracto respiratorio superior y esta característica importante fue replicado en las crías de rata por no traumatic de la instilación de las bacterias sobre las membranas de los pasajes nasales. Es importante destacar que la naturaleza dependiente de la edad de la infección se repitió en el modelo.

El mismo grupo también fueron los primeros en desarrollar un modelo no-invasiva de E. coli K1 NBM en la rata neonatal 22. Cachorros Sprague-Dawley libres de patógenos fueron colonizados por la alimentación de 10 agosto hasta 10 octubre bacterias a través de una sonda gástrica por vía oral; El inóculo fue, por tanto, considerablemente más alta que la empleada por nosotros. La colonización con las tres cepas K1 examinaron, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) y LH (O75: K1: H3), se produjo en una proporción relativamente alta (48-74%) de K1 animales alimentados, pero la incidencia de bacteriemia, meningitis y la mortalidad fueron variables y significativamente inferiores a las tasas de colonización. La naturaleza clonal de E. infección experimental coli K1 se estableció más tarde 23 y ahora es evidente que sólo O18: K1 y, en menor medida, O7: K1 serotipos son capacespara causar consistentemente infección sistémica. Por esta razón, estas investigaciones de la patogénesis de E. neuropatogénico coli K1 se basa en el uso de la O18 virulencia mejorada: K1 cepa A192PP. Una comparación de E. coli K1 alimentación de ratas neonatales a través de un tubo gástrico, como el usado por Glode y sus colegas 22, y un método de alimentación por goteo como se emplea por el grupo de Achtman 23 reveló un número excesivo de muertes utilizando el método anterior, es casi seguro que debido a los daños a las superficies mucosas por parte de la tubo gástrico. Como las tasas de colonización son comparables con estos dos métodos, se recomienda utilizar el método menos invasivo de la alimentación de las bacterias utilizando una pipeta con una punta estéril, tal como se describe en esta comunicación.

E. coli cepa A192PP utilizado en nuestros estudios es O18: K1. Es un derivado más virulento de la cepa clínica E. coli A192 que se recuperó originalmente de un paciente con septicemia 27 </sup>. El aumento de la virulencia de la cepa se obtuvo mediante pases en serie a través de ratas neonatales 26. La cepa provoca una gravedad de la enfermedad depende de la edad, con un 100% de bacteriemia y mortalidad cuando se administra hasta 2 días de edad los animales 28. En contraste, 9 días de edad los animales son completamente resistentes a la enfermedad. -K1 específica bacteriófago lítico se puede utilizar para diferenciar E. coli K1 de otras E. coli cepas 29. En este estudio, la susceptibilidad de las bacterias viables para K1E bacteriófago se debe utilizar para (i) comprobar la pureza de la E. suspensiones coli K1 preparados para ser alimentados a los animales, y (ii) para diferenciar E. coli K1 de otros coliformes para calcular la viabilidad en hisopos perianales, sangre y muestras de tejido. Si la colonia es E. coli K1, será susceptible a la lisis K1E bacteriófago, y el crecimiento bacteriano se inhibió en el sitio de la inoculación bacteriófago. Si la colonia no es E. coli K1, se bresistente a la lisis KIE bacteriófago e, y debe haber un área de crecimiento bacteriano en el sitio de la inoculación bacteriófago. Debe tenerse en cuenta que los modelos animales no pueden reflejar todas las características de la enfermedad de origen natural. El modelo actual puede ser modificado para examinar las características de virulencia de bacterias distintas de E. neuropatogénico coli A192PP y las variaciones en el tamaño del inóculo colonizar pueden ser acomodados. Las futuras aplicaciones de la técnica pueden incluir la evaluación de medicamentos muy necesarios para el tratamiento de la enfermedad y para descubrir los detalles de la respuesta del huésped a la invasión y colonización de los tejidos.

El método descrito aquí es simple pero eficaz. Se utilizaron 12 crías como grupos de prueba o de control y este enfoque dentro de la camada asegura un alto grado de reproducibilidad y validez estadística – camadas individuales de 10. Es imperativo que los cachorros son devueltos a sus madres naturales tan pronto como sea posible después de cualquier procedurcorreo y camadas no deben, por tanto, comprender los animales sometidos a diferentes intervenciones. Es importante que el inóculo Fed ser calentada de otro modo los cachorros rechazarán la cultura ofrecido. Las crías se desarrollan rápidamente una microbiota compleja y dentro de los dos días de nacer, el tracto gastrointestinal está colonizado con una amplia gama de bacterias de los filos establecido como las más abundantes microbios en el niño y el adulto intestino. Los cachorros que no han sido alimentados con E. coli A192PP no llevan E. coli K1 en el tracto GI 17 y así la determinación de las tasas de colonización es relativamente sencillo. Sin embargo, el método -basado Neus qPCR para la detección de la colonización de E. coli K1 es mucho más sensible que los métodos de cultivo tradicionales y se recomienda 17.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por becas de investigación G0400268 y MR / K018396 / 1 del Consejo de Investigación Médica, y por la Acción de Investigación Médica. Más apoyo fue proporcionado por el Instituto Nacional de Londres Hospitales Centro de Investigación Biomédica Escuela Universitaria de Investigación en Salud.

Materials

Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) Harlan, UK www.harlan.com
E. coli K1 A192PP Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Glycerol  Sigma, UK www.sigmaaldrich.com G5516
Mueller-Hinton Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0337
Mueller-Hinton Broth Oxoid, UK www.oxoid.com CM0405
MacConkey Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0007
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P4417
Ethanol 100% Sigma, UK www.sigmaaldrich.com E7023
Heparin Sodium Salt Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 84020
Prepare 20-50 units/ml
RNAlater Solution Sigma, UK www.sigmaaldrich.com R0901
10µl/mg tissue
Acetic Acid Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 320099
Chloroform Sigma, UK www.sigmaaldrich.com C2432
Methanol Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 322415
Cotton-tipped swabs Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 11542483
Alcotip Swabs Scientific Laboratory Supplies, UK www.scientificlabs.co.uk SWA1000
Petri dishes Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P5856
30mL Universal Tube AlphaLaboratories, UK www.alphalabs.co.uk CW3890
0.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1405-1500
1.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1415-1000
0.1µl calibrated loops StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-0112
L-shaped spreaders StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-1005
Cuvettes Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 10594175
Forceps straight with fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12780036
Forceps straight with blunt tips Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points  Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12740926
Scissors straight with very fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12972055
Laboratory Scissors VWR, UK www.vwr.com USBE4251
25g Syringe Needles Greiner Bio-One Ltd www.greinerbioone.com N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers PerkinElmer, UK www.perkinelmer.co.uk L60000BB
Unitemp Incubator B&T, UK OP958
Multitron shaking incubator INFORS HT, UK www.infors-ht.com AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer IKA Werke www.ika.com 0003737000
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Referências

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Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M. H., Taylor, P. W. Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat. J. Vis. Exp. (92), e52018, doi:10.3791/52018 (2014).
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