Teelt van zoogdiercellen met behulp van een Single-use Pneumatische bioreactorsysteem
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
Zoogdier cellijnen kunnen worden ingedeeld in drie categorieën op basis van hun groei eigenschappen: cellen die in suspensie groeien, cellen die groeien als aggregaat, en cellen die verankerd groeien op een substraat. Hoewel de lucht-wiel bioreactor gedemonstreerd in deze video is in staat om alle drie de soorten cellen te laten groeien, zal deze video gebruik van de bioreactor tot verankering afhankelijke cellen groeien op micro-dragers demonstreren. Ankerplaats afhankelijke zoogdiercellen kunnen worden gekweekt voor het produceren van meer cellen – waarbij de cellen zelf het product. Bijvoorbeeld, menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen nog geteeld met het oog op het oogsten van de cellen en injecteren in ziek weefsel. De pneumatische bioreactor aangetoond in deze video geschikt gebleken voor de productie van dergelijke mesenchymale stamcellen voor deze toepassing (Serra et al., Persoonlijke mededeling, 2013).
Anchorage dependent zoogdiercellen worden meestal geteeld op kleine schaal in 2D cultuur schepen zoals celkweek platen, celkweek kolven, of roller flessen, waar zij zich aan een speciaal behandelde groei oppervlak 1. Wanneer meer cellen gewenst zijn, kunnen de platen of kolven worden uitgebreid door meer of grotere schepen. Voor meer rendabele teelt van grote hoeveelheden verankering afhankelijke cellen, de oppervlakte, celhechting kan worden bereikt door gebruik solid beads genaamd micro-dragers. Afhankelijk van de bevestiging kenmerken van de cel, verschillende soorten micro-dragers zijn commercieel verkrijgbaar, zoals dextran, peptide of collageen bekleed. Micro-dragers hebben een groot oppervlak tot volume verhouding verschaffen van een groter oppervlak voor celgroei; en micro-dragers worden in suspensie gehouden onder roeren, waardoor de cellen worden gekweekt tot hoge dichtheden in bioreactorsystemen 2. Momenteel is de soort bioreactors waar hechtende cellen worden gekweekt op micro-dragers omvatten spinnerkolven en geroerde tank systemen, die aspropellers gebruiken om opschorting van de cel gecoate micro-dragers te behouden.
Verschillende factoren zijn belangrijk voor de succesvolle kweek van cellen waaronder zuurstofspanning, schuifspanning, oppervlakte matrix en nutriënten en metaboliet concentraties. Het gebruik van bioreactoren zorgt voor real-time monitoring van de groei-omstandigheden en het potentieel om aanzienlijk lagere productiekosten 1. Er zijn verschillende gemeenschappelijke bioreactor ontwerpen voor in vitro celkweek inclusief, geroerde suspensie, roterende vaatwand, holle vezel, zak bioreactor op een rocker-platform, en wervelbed systemen 3. Veel van deze systemen te presenteren unieke problemen voor celkweek en schaal -up, zoals hoge kosten, voedingsstoffen concentratiegradiënten, hydrodynamische shear, cel aggregatie, en moeite met steekproefsgewijs controles en controlerende cell opschaling.
Verschillende hechtende cellijnen worden gebruikt bij de productie van virussen, in de productie van virale vaccins of voor de productie van virale vectoren voor gentherapie toepassingen. In deze video, met behulp van de voor eenmalig gebruik pneumatische (lucht-Wheel) bioreactor systeem, tonen we de cultuur van de menselijke long carcinoom cellen (A549) cellen op micro-dragers voor de productie van een oncolytisch adenovirus. De pneumatische bioreactor gebruikt een verticale agitatie wiel dat wordt aangedreven door het drijfvermogen van gas gesprenkeld in de bodem van de bioreactor. Dit zachtjes roeren methode beperkt hydrodynamische dwarskrachten, maar nog steeds zorgt voor een optimale medium en cel mengen 4. In vergelijking met de geroerde tank reactor, de pneumatische reactor lage afschuifspanning ook bij hoge volume Air-Wheel bioreactor systemen (figuur 1). In tegenstelling tot geroerde tank bioreactoren, is de verticale schoepenrad is opgebruikt reactor gedraaid een gas stroomt binnenhet vaartuig, die zorgt voor zachte en uniforme menging medium (figuur 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze single-use bioreactor systeem is relatief eenvoudig te gebruiken en biedt real-time analytics voor reactor monitoring en analyse. Het is zeer goed geschikt voor zoogdieren en insecten celcultuur met cel dichtheden bereiken van meer dan 30 miljoen cellen / ml. Naast beschreven A549-cellen in dit verslag 11, hebben we SF-9 insectencellen gekweekt in de bioreactor ook. Het voorzichtig mengen door de pneumatische wiel vermindert celbeschadiging. Verschillende stappen zijn van cruciaal belang bij het opzetten van deze reactor. Ten eerste, de juiste kalibratie van de pH en DO sensoren om optimaal controle van de kweek en toevoeging van reagentia om de pH of de zuurstof in het systeem aan te passen. Ten tweede moet het serum en zaad flessen worden gevuld en de luer bijlagen in een steriele omgeving, zoals een BSC. Wanneer het reagens flessen weggeklapt, steriele omgeving, moet de verbindingen met de bioreactor toevoerleidingen voorzichtig worden geïnterpreteerd microbiële contaminatie te voorkomen.
<pclass = "jove_content"> Hoewel dit bioreactorsysteem werkt goed voor zoogdieren en insecten cellijnen is niet bedoeld voor bacteriële kweken. Het systeem kan niet over een snelle menging en zuurstof die nodig is voor bacteriële cellen. Bacteriële groei best verwezenlijkt in een geroerde tank bioreactor. In vergelijking met andere enkel gebruik bioreactoren voor zoogdierlijke of insecten celcultuur dit systeem eenvoudig te gebruiken, voldoende gegevens voor analyse van runs en heeft vergelijkbare of betere celgroei dan de andere voor eenmalig gebruik stelsel we geëvalueerd.Het eenmalig gebruik pneumatische bioreactorsysteem heeft de potentie om veel onderzoek en klinische toepassingen op het gebied van biologische geneesmiddelen vaccins voldoen, stamcellen en gepersonaliseerde geneeskunde 4. Bovendien, de flexibiliteit van dit systeem maakt Batch, Fed-batch, Perfusie en transfectie gebaseerde bioreactor toepassingen 5. Tot slot, voor eenmalig gebruik disposable bioreactor systemen hebben de potentieel aan de behoeften van grootschalige industriële productie te ontmoeten en zich te houden aan de richtsnoeren en aanbevelingen van de nationale en internationale regelgevende instanties 6-10.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
Referências
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).
- Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).
- Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).
- Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).
- Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).
- Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. , (2010).
- Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).
- DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. . Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).
