Выращивание клетках млекопитающих с использованием одноразовых Пневматический биореактора системы
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
Клетки млекопитающих линии могут быть отнесены к одной из трех категорий в зависимости от их характеристик роста: клетки, которые растут в суспензии, клеток, которые растут в виде агрегатов, а клетки, которые растут на якорь на подложку. Хотя воздух колеса биореактор показано в этом видео может расти все три типа клеток, это видео будет продемонстрировать использование биореактора для выращивания фиксационно-зависимых клеток на микро-носителей. Анкоридж зависимые клетки млекопитающих могут быть выращены с целью производить больше клеток – когда сами клетки являются продуктом. Например, костного мозга человека мезенхимальных стволовых клеток в настоящее время культивируют с целью сбора клеток и их инжекции в пораженной ткани. Пневматическая биореактор показано в этом видео доказала подходит для производства таких мезенхимальных стволовых клеток для этого приложения (Серра и соавт., Частное сообщение, 2013).
Анкоридж DEPendent клетки млекопитающих обычно выращиваются небольшой масштаб в 2D сосудов для культивирования таких как культуры клеток пластин, культуры клеток колбах или роллер-флаконах, где они придерживаются специально обработанной поверхности роста 1. При более ячеек желательно, пластины или колбы могут быть расширены с помощью более или большие суда. Тем не менее, для более экономичного выращивания больших количеств крепления зависимых клеток, увеличивая площадь поверхности для крепления сотового может быть достигнуто с помощью небольших твердых бусин называемые микро-носители. В зависимости от характеристик прикрепления клетки, несколько различных типов микро-носителей являются коммерчески доступными, например, декстран, пептид, или коллаген покрытием. Микро-носители имеют большую площадь поверхности к объему, обеспечивающей большую площадь поверхности для роста клеток; и микро-носители могут быть сохранены в виде суспензии при перемешивании, что позволяет клеткам культивироваться до высоких плотностей в биореакторе систем 2. В настоящее время, виды bioreactors где прикрепленные клетки, выращенные на микро-носителей включают вращающихся колбах и перемешивают нефтехранилище, которые используют осевые рабочие колеса для поддержания суспензии клеток покрытием микро-носителей.
Несколько факторы важны для успешного выращивания клеток, включая напряжения кислорода, напряжение сдвига, поверхности матрицы, и питательных веществ и метаболитов концентрациях. Использование биореакторов позволяет контролировать в режиме реального времени в условиях роста и потенциал для значительного снижения производственных затрат 1. Есть несколько проектов общей биореактор для выращивания в пробирке клеток в том числе, перемешивают суспензию, вращающейся стенки сосуда, полого волокна, мешок биореакторе на рокера платформы, и системах с кипящим слоем 3. Многие из этих систем представляют уникальные проблемы для выращивания клеток и масштабировать посуды, такие как высокая стоимость, питательных градиентов концентрации, гидродинамического сдвига, агрегации клеток, а также трудности в отборе проб, мониторинга и контрольного сотовыхл масштаб деятельности.
Различные клеточные линии, прилипшие используются в производстве вирусов, либо в производстве вирусных вакцин или для производства вирусных векторов для применения генной терапии. В этом видео, используя одноразовый пневматические (Air-колеса) биореактор системы, мы демонстрируем культуру клеток человека карциномы легкого (А549) клеток на микро-носителей для производства в онколитических аденовируса. Пневматическая конструкции биореактора использует вертикальное колесо перемешивания, что питается от плавучести газа разбрызгивают в нижней части биореактора. Это щадящий метод перемешивание ограничивает гидродинамические силы сдвига, но все еще обеспечивает оптимальной средой и клетки смешивания 4. По сравнению с реактор с мешалкой, пневматический реактор имеет низкую напряжения сдвига стены даже с большими объемами систем воздушного колеса биореактора (рисунок 1). В отличие от перемешивают биореакторах цистерн, вертикальное колесо этого одноразового использования реактора включен потоком пузырьков газа внутриСудно, которое позволяет нежный и равномерного перемешивания среды (рисунок 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Это одноразовая система биореактора является относительно простым в использовании и позволяет в реальном времени аналитики для мониторинга и анализа реактора. Это очень хорошо подходит для млекопитающих и насекомых клеточной культуры с плотностью клеток, достигающих более 30 миллионов клеток / мл. Кроме того А549 описано в настоящем докладе 11, мы выросли SF-9 клеток насекомых в биореакторе, а также. Бережное смешивание обеспечивается пневматическим воздуха колеса уменьшает повреждения клеток. Несколько шагов имеют решающее значение при настройке этого реактора. Во-первых, собственно калибровки рН и DO датчики важно для оптимального мониторинга культуры и добавлением реагентов для доведения рН или кислорода в системе. Во-вторых, реагента и семенные бутылки должны быть заполнены и вложения Luer сделано в стерильной среде, такой как BSC. После того, как бутылки с реагентами перемещаются из стерильной среде, соединения с линиями подачи биореактора должно быть сделано с осторожностью, чтобы избежать микробного загрязнения.
<pкласс = "jove_content"> Хотя это биореактор система хорошо работает для млекопитающих и насекомых клеточных линий, не предназначенных для бактериальных культур. Система не может обеспечить быстрое перемешивание и кислородом, который необходим для бактериальных клеток. Рост бактерий лучше всего достигается в биореакторе мешалкой. По сравнению с другими биореакторах одноразового использования для млекопитающих или насекомых культуре клеток, эта система проста в использовании, обеспечивает достаточные данные для анализа трасс, и имеет сходную или лучшую рост клеток, чем другой одноразового использования системы мы оценивали.Одноразовый Пневматическая система биореактор имеет потенциал для удовлетворения многих исследований и клинического применения в областях биотерапевтических, вакцин, стволовые клетки, и персонализированной медицины 4. Кроме того, гибкость этой системы позволяет единовременной загрузке, при периодическом, перфузии, и трансфекции на основе биореактора приложений 5. Наконец, одноразовые одноразовые биореакторные системы имеют POTENтомобиля удовлетворения потребностей крупномасштабного промышленного производства и придерживаться принципов и рекомендаций национальных и международных регулирующих органов 6-10.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
Referências
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).
- Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).
- Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).
- Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).
- Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).
- Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. , (2010).
- Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).
- DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. . Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).
