O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor
Summary
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
Linhagens de células de mamíferos podem ser classificados em uma das três categorias com base em suas características de crescimento: as células que crescem em suspensão, as células que crescem como agregados, e as células que crescem ancorados a um substrato. Embora o biorreactor ar rodas demonstrado neste vídeo é capaz de crescer todos os três tipos de células, este vídeo vai demonstrar a utilização do biorreactor de cultivo de células dependentes de ancoragem em micro-transportadores. Células de mamíferos dependentes de ancoragem podem ser cultivadas para fins de produção de mais células – onde as próprias células são o produto. Por exemplo, derivadas da medula óssea as células estaminais mesenquimais humanas estão actualmente a ser cultivadas com a finalidade de recolher as células e injectando-os em tecido doente. O bioreactor pneumático demonstrado neste vídeo provou adequado para a produção de tais células estaminais mesenquimais para esta aplicação (Serra et al., Comunicação pessoal, 2013).
Anchorage depAs células de mamíferos são geralmente cultivadas endent pequena escala em recipientes de cultura em 2D, como placas de cultura de células, frascos de cultura de células, ou garrafas de rolo, onde eles aderem a uma superfície de crescimento especialmente tratado 1. Quando as células são mais desejado, as placas ou frascos pode ser expandida através da utilização de mais ou maiores navios. No entanto, para o cultivo mais eficaz em termos de custos de grandes quantidades de células dependentes de ancoragem, aumentando a área de superfície para a fixação das células pode ser conseguida pela utilização de pequenas esferas sólidas chamados micro-transportadores. Dependendo das características de ligação da célula, vários tipos diferentes de micro-transportadores estão disponíveis comercialmente, tais como dextrano, péptido, ou colagénio revestido. Os micro-transportadores têm uma grande área de superfície em relação ao volume proporcionando uma maior área de superfície para o crescimento celular; e os micro-transportadores podem ser mantidas em suspensão, com agitação, o que permite que as células a ser cultivadas a elevadas densidades em sistemas de biorreactor 2. Atualmente, os tipos de bioreactors onde as células aderentes são cultivadas em micro-veículos incluem frascos spinner e sistemas de tanque agitado, que utilizam rotores axiais para manter uma suspensão de células revestidas micro-portadores.
Vários fatores são importantes para o cultivo bem sucedido de células, incluindo a tensão de oxigênio, tensão de cisalhamento, matriz de superfície, e de nutrientes e as concentrações do metabolito. O uso de biorreatores permite o monitoramento em tempo real das condições de crescimento e potencial para significativamente mais baixos custos de produção 1. Existem vários modelos de biorreatores comum para o cultivo in vitro de células, incluindo, suspensão agitada, girando navio parede, de fibra oca, saco de biorreator em uma plataforma central, e sistemas de leito fluidizado 3. Muitos destes sistemas apresentam problemas específicos para o cultivo de células e escalar -up, como alto custo, gradientes de concentração de nutrientes, cisalhamento hidrodinâmico, agregação celular, e dificuldade de amostragem, monitoramento e controle cell scale-up.
Várias linhas de células aderentes são utilizados na produção de vírus, quer na produção de vacinas virais ou para a produção de vectores virais para as aplicações de terapia génica. Neste vídeo, utilizando o uso único pneumático (Ar-roda) do sistema biorreactor, que demonstram a cultura de células de carcinoma de pulmão humano (A549) em células de micro-transportadores para a produção de um adenovírus oncolítico. O desenho biorreator pneumático usa uma roda de agitação vertical que é alimentado pela flutuabilidade de gás aspergido na parte inferior do bioreactor. Este método suave agitação limita as forças de cisalhamento hidrodinâmicos, mas ainda garante ótima médio e célula de mistura 4. Em comparação com o reactor de tanque com agitação, o reactor de pneumático tem uma baixa tensão de corte na parede, mesmo com grandes volumes de sistemas de reactores biológicos de ar-roda (Figura 1). Em contraste com o bio-reactores de tanque agitado, o rotor vertical de uso único, este reactor é ligado por uma corrente de bolhas de gás dentroo recipiente, o que permite uma suave e uniforme de mistura média (Figura 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este sistema de biorreatores de uso único é relativamente simples de usar e oferece análises em tempo real para o acompanhamento e análise do reator. É extremamente bem adequado para a cultura de células de mamíferos e insetos com densidades celulares atingindo mais de 30 milhões de células / ml. Além de células A549 descrito neste relatório 11, que cresceram células SF-9 de insecto em bioreactor bem. A mistura suave fornecido pela roda pneumática reduz os danos celulares. Vários passos são fundamentais quando configurou este reator. Primeiro calibração, adequado do pH e DO sensores é importante para a monitorização óptima da cultura e para a adição de reagentes para ajustar o pH, ou o oxigénio no sistema. Em segundo lugar, as garrafas de reagente e de sementes devem ser preenchidos e os acessórios luer feito num ambiente estéril, tal como um BSC. Uma vez que os frascos de reagentes são movidos para fora do ambiente estéril, as conexões com as linhas de alimentação de biorreatores deve ser feita com cuidado para evitar a contaminação microbiana.
<pclass = "jove_content"> Embora este sistema biorreator funciona bem para linhas celulares de mamíferos e insetos, não é projetado para culturas bacterianas. O sistema não pode fornecer a mistura rápida e oxigenação, que é necessária para as células bacterianas. O crescimento bacteriano é melhor realizado em um biorreator de tanque agitado. Em comparação com outros bio-reactores de utilização única para a cultura de células de mamífero ou de insecto, o sistema é fácil de usar, que fornece dados suficientes para análise de pistas, e tem um crescimento celular semelhante ou melhor do que o outro sistema de uso único, nós avaliamos.O uso único sistema biorreator pneumático tem o potencial de atender a muitas das pesquisas e aplicações clínicas nas áreas de biotherapeutics, vacinas, células-tronco e medicina personalizada 4. Além disso, a flexibilidade do sistema permite Batch, Fed-batch, Perfusão, e transfecção aplicações baseadas biorreator 5. Finalmente, de uso único sistemas de biorreatores descartáveis têm o potencial para atender às necessidades da produção industrial em grande escala e para aderir às diretrizes e recomendações dos órgãos reguladores nacionais e internacionais 6-10.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
Referências
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