Tek Düzlem Aydınlatma Modülü ve geniş alan Mikroskop Mikro-kılcal Yaklaşım
Summary
Tek düzlem aydınlatma mikroskopi için bir modül (SPIM) kolay bir şekilde ters geniş alan mikroskobu üzere uyarlanmıştır ve 3-boyutlu hücre kültürleri için optimize edildiği açıklanmaktadır. Numune bir dikdörtgen kılcal içinde yer almaktadır ve mikro-akışkan sistem floresan boyalar ile, farmasötik maddeler ya da ilaç küçük miktarlarda uygulanabilir.
Abstract
Kolayca ters geniş alan mikroskobu üzere uyarlanmıştır ve 3-boyutlu hücre kültürleri için optimize edilmiş anlatılan ışık tabaka ya da tek bir düzlem aydınlatma mikroskobu (SPIM) için bir modül, örneğin, çok hücreli tümör sferoidler (MCTS). SPIM uyarma modülü şekiller ve örnek dik mikroskop algılama yoluna açık tabaka ile aydınlatılacak şekilde ışığın yönünü değiştirir. Sistem aydınlatan ışık tabakanın her iki ayar durumunda ve hem de floresan tespiti için kullanılan objektif mercek tarafından, örneklerin (aynı zamanda döndürülmesi için bir mikro-kapiller yaklaşımı ve gelişmiş bir versiyonu) tutmak için dikdörtgen kılcal kullanılması ile karakterize edilir Floresan boyalar, küçük miktarlarda farmasötik maddeler ya da ilaç uygulaması için bir mikro-akışkan sistemi adaptasyonu. Bu sistem ile çalışmak için bir protokol verilir ve bazı teknik detaylar bildirilmektedir. Temsilcisi sonuçları up (1) ölçümlerini içermektedirbir oksitleyici madde ilave edilmesi üzerine bir sitostatik ilaç (doksorubisin) ve bir bozunma ürünü olan kısmi dönüşüm genetik olarak kodlanmış glutation sensörünün kullanılmasıyla, (2) bir redoks ölçüm yapmak, ve (3) başlangıç ve inhibisyon sonucunda nekroz etiketleme mitokondriyal solunum zinciri. Mevcut sistemler ile karşılaştırıldığında, bu SPIM modülünün farklılıklar ve avantajları tartışılacaktır.
Introduction
Iyi kurulmuş yöntemleri (konfokal veya çoklu foton lazer tarama mikroskopisi 1-4, yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi 5,6) hafif levha veya tek düzlem aydınlatma mikroskobu (SPIM) ek olarak 3D görüntüleme 7,8 değerli bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır, 9. Özel ilgi ilaç keşfi araştırmaları 10,11 giderek kullanılan 3 boyutlu hücre kültürleri, örneğin, çok hücreli tümör sferoidlerle (MCTS), onun uygulamadır. Ayrıca, SPIM hatta uzun süreli maruz kalma ya da yineleyici ölçümleri üzerine düşük ışık dozunun yalnızca bu düzlem ışığına maruz numunenin her düzlemde ölçümü için yana, numunenin canlılığını korumak için gerekli olan tercih edilen bir yöntemdir. Bu, her bir odaklama düzleminin tespiti için tüm numune aydınlatılır diğer mikroskopi teknikleri, aksine, ışık dozu özetliyor sayıda düzlemin üzerine kaydedilmesi ve böylece örnek 12 zarar verebilir. </p>
Işık mikroskobu ya da tabaka SPIM silindirik lens kullanımı ile ya da (bir yorumda bakınız Ref. 8) verici lazer ışını tarayarak ya da gözlem yoluna dik yönde numunenin aydınlatma dayanmaktadır. Bu genellikle özel örnek odaları 13,14 veya matrisinim gerektirir örneğin, agaroz 7,15, özel yüksek maliyetli mikroskoplar uygulanmaktadır. Bu sistemlere bir alternatif olarak SPIM için nispeten basit bir aydınlatma aygıtı geliştirilmiştir ve bu geleneksel bir ters mikroskop 16 (Şekil 1 'e bakınız) özel olarak uyarlanmıştır. Yaklaşık 100 um arasında bir alan derinliği üzerinde 6-10 um kalınlıkta ince bir tabakaya bir silindirik bir mercek (0.08: 50 mm, sayısal açıklık odak uzunluğu) 8 mm'lik bir çapa genişletilmiş ve odaklanmış bir lazer ışını içerir . Örnekler mikroskop objektif len önüne yerleştirilen 600-900 mikron iç çapa sahip olan bir dikdörtgen kılcal bulunurfloresan tespiti için lar. Bu ana özellikleri şu anda tamamlanan ve tutmak için ve floresans saptama (aynı optik yol boyunca ikinci (eksenel yönde) örnekleri, aydınlatan ışık tabakanın senkron uyum ve objektif lens döndürülmesi için gelişmiş mikro-kapiller yaklaşımların kullanımı optimize edilmiştir deplasman uzunlukları böylece gerekli miktarlarda ve giderleri en aza indirmek, mekanik itmesinin bir düzeltilmesi) ve floresan boyalar, farmasötik maddeler ya da ilaç uygulaması için bir mikroakışkan sisteminin uyum gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazması bir ışık tabakası veya 3-boyutlu hücre sistemleri için optimize edilmiştir tek düzlem aydınlatma mikroskobu (SPIM) aygıtı, örneğin çok hücreli tümör sferoitleri (MCTS) açıklar. Üç örnek uygulamaları (1), bir sitostatik ilacın alınması ve (kemoterapötik etkinliğe katkısı hala değerlendirilmesi gereken kalır), bir bozunma ürününe onun kısmi dönüşüm, genetik olarak kodlanmış glutation sensörünün kullanımı üzerine ile redoks durumunun (2) ölçümlerdir…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Kara, Baden-Württemberg tarafından yanı sıra Avrupa Birliği, Europäischer Fonds tarafından finanse für Regionale ENTWICKLUNG die edildi. Yazarlar usta teknik yardım için U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 hücre hattı ve Claudia HINTZE sağlamak için Rainer Wittig (ILM Ulm) teşekkür ederim.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
Referências
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
