Одноместный самолет Освещение модуль и Micro-капиллярной подход для широкого поля микроскопа
Summary
Модуль для одной плоскости освещения микроскопии (SPIM) описывается который легко адаптируется к перевернутой широкого поля микроскопа и оптимизирован для культур 3-мерных клеток. Образец находится в пределах прямоугольного капилляра, а также через микрожидком красителей системы люминесцентных, фармацевтические агенты или лекарственные средства могут быть применены в небольших количествах.
Abstract
Модуль для легкой листа или одной плоскости освещения микроскопии (SPIM) описывается который легко адаптируется к перевернутой широкого поля микроскопа и оптимизирован для культур 3-мерных клеток, например, многоклеточные опухолевых сфероидов (MCTS). Модуль возбуждения SPIM формы и отклоняет свет таким образом, что образец облучается световым листа, перпендикулярном пути обнаружения микроскопа. Система характеризуется использованием прямоугольной капилляра для проведения (и в расширенной версии также микро-капиллярной подхода для вращения) образцов, с помощью синхронного регулировки освещающего света листом и линзы объектива, используемого для обнаружения флуоресценции, а также путем адаптации микрожидком системы для применения флуоресцентных красителей, фармацевтических препаратов или препаратов в небольших количествах. Протокол для работы с этой системой дается, и некоторые технические детали, как сообщается. Представитель результаты включают (1) измерения допринимают из цитостатического препарата (доксорубицин) и его частичного преобразования к деградации продукта, (2) измерение окислительно-восстановительные с использованием генетически закодированного датчика глутатиона при добавлении окислителем, и (3) инициирование и маркировка некроза клеток на ингибирование дыхательной цепи митохондрий. Обсуждаются различия и преимущества настоящего SPIM модуля по сравнению с существующими системами.
Introduction
В дополнение к хорошо известными способами (конфокальной или многофотонное лазерная микроскопия 1-4, структурированы освещение микроскопии 5,6) свет листовых или одиночный самолет освещение микроскопии (SPIM) оказалась ценным методом 3D визуализации 7,8, 9. Особый интерес представляет его применение к 3-мерных клеточных культурах, например, многоклеточных опухолевых сфероидов (MCTS), которые используются чаще для исследования по поиску новых лекарств 10,11. Кроме того, SPIM льготная метод, когда даже при длительном воздействии или повторных измерений низкие световых дозах необходимы для поддержания жизнеспособности сэмпла, так как для измерения каждой плоскости образца только этот самолет подвергается воздействию света. Это в отличие от других методов микроскопии, где для обнаружения каждой фокальной плоскости освещенных весь образец, так что при записи многочисленных самолетов суммы свет дозы и может привести к повреждению образца 12. </р>
Свет листа микроскопии или SPIM основан на освещении образца в перпендикулярном направлении к пути наблюдения или при использовании цилиндрической линзы или путем сканирования возбуждающего лазерного луча (для обзора см. 8). Это часто требует особого образца камеры 13,14 или матрицы, например, агарозном 7,15, реализованы в специальных дорогостоящих микроскопов. В качестве альтернативы этих систем сравнительно просто Осветительное устройство по SPIM была разработана и адаптирована к обычным инвертированным микроскопом (16 рисунок 1). Он состоит из лазерного луча расширенной до диаметра 8 мм и фокусируется цилиндрической линзой (фокусное расстояние: 50 мм, с числовой апертурой 0.08) до светло-листа 6-10 толщиной мкм над глубиной резкости около 100 мкм . Образцы расположены в прямоугольном капилляр с внутренним диаметром 600-900 мкм, помещенной в передней части объектива микроскопа Lenс регистрации флуоресценции. Эти основные особенности в настоящее время завершена, и оптимизирована за счет использования передовых микро-капиллярных подходов для проведения и возможность вращения образцов, синхронную регулировку освещающего света листа (в осевом направлении) и объектива, используемые для обнаружения флуоресценции (идентичны оптического пути длины перемещения требуют коррекции механической подачей), и адаптацию микрофлюидном системы для применения флуоресцентных красителей, фармацевтических препаратов или препаратов, тем самым сводя к минимуму необходимых количествах и расходы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий рукопись описывает легкий лист или один самолет освещение микроскопия (SPIM) устройство, которое оптимизировано для систем 3-мерных клеток, например, многоклеточных опухолевых сфероидов (MCTS). Три примерные области применения включают (1) поглощение цитостатического препар…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался земли Баден-Вюртемберг, а также Европейским Союзом, Europäischer Fonds für умереть Regionale Entwicklung. Авторы благодарят Rainer Виттиг (ILM Ульм) для обеспечения клеточной линии U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 и Клаудия Hintze для умелого технической помощи.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
Referências
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
