Выделение и культуры диссоциированных сенсорные нейроны От куриные эмбрионы

Нейроны являются сложными клетки, которые несут информацию, необходимую для выполнения различных функций, включая ощущения, зрение, движения двигателя, обучения и памяти. Уникальная от других типов клеток, нейронов расширить рук, как процессы, называемые аксоны, чтобы сформировать основные нервные дороги для связи. Во время развития специализируется отсеков, расположенных на кончиках растущих аксонов, называется конусы роста, перемещаться по концерта внеклеточных сигналов, чтобы привести аксон к ее соответствующему назначению. Сложные молекулярные механизмы, лежащие в основе роста конус навигацию, полностью не поняты. Чтобы лучше понять эти механизмы, исследователи использовали модели клеточной культуры для изучения нейронов в определенной и упрощенной в пробирке среды. Изучение нейронов в культуре ¹ привело к значительному прогрессу в нашем понимании нейронов клеточной биологии, включая: дифференцировки нейронов ^2, цитоскелета динамики, эндоцитоза и торговли, дендритоврегулирование ^3,4, регенерацию аксонов ^5, и клинические состояния, такие как невропатии ^6. Кроме того, культивируемые нейроны являются весьма пригодны для широкого спектра методов исследования, включая иммуноцитохимии, клеточной поверхности ко-иммунопреципитации, Вестерн-блоттинга, трансфекции, RNAi, и живого изображения, такие как TimeLapse анализа конуса роста подвижности. Таким образом, культивирование первичных нейронов является мощным подход к выяснению многочисленные аспекты клеточной биологии нейронов.

Модель культуры клеток обеспечивает следователям подробного контроля над условиями окружающей среды и переменных. Например, субстрат, на котором нейроны покрытием (и расти на) можно легко манипулировать. Здесь мы предоставляем подробные инструкции для генерации две различные субстраты, один с низкой концентрацией ламинином-1, а другой с насыщающих концентраций ламинином-1. Удивительно, различные концентрации и той же молекулы может иметь драматические последствияот внутреннего состояния нейронов, а также их клеточной поверхности композиции. Например, внутриклеточные уровни цАМФ и поверхностных уровнях интегринов значительно отличаются в нейронах посеянных на этих двух субстратов ^7,8. Дополнительные исследования показали, что другие молекулы, в том числе фибронектина и хондроитинсульфата протеогликаны, воздействия на экспрессию молекул клеточной поверхности и нейронов моторики ^7-11. Кроме того, растворимые молекулы, такие как нейротропинов и neurotropins также влияют на состав клеточной мембраны нейронов и моторику ^12-16 и может быть легко и точно управлять в модели культуры клеток.

Здесь мы опишем методы, чтобы изолировать и культуры диссоциированных сенсорные нейроны от куриных эмбрионов. Эта процедура была использована, чтобы сделать значительные прорывы в области нейробиологии, в том числе аксонов ^{5,7,8,10,11,16-21} и был изменен с процедурой для изоляции ганглиозных клеток ^22. Естьнесколько преимуществ такого подхода. Во-первых, многие черты цыплят спинномозговых ганглиев (DRG) развития хорошо охарактеризованы в том числе сроков рождения, расширение аксона, и экспрессия белка анкеты ^2,23-28, обеспечивая тем самым поучительный основу, на которой строится информативным в пробирке эксперименты. Во-вторых, диссоциированных нейронов культуры позволяют исследователю более непосредственно изучать нейронов по сравнению с альтернативными подходами с использованием интактных DRG эксплантов (которые содержат нейроны и не-нейрональных клеток) и / или смешанных культур, содержащие оба диссоциированных нейронов и не-нейрональных клетках. В-третьих, процедура, описанная здесь проста, недорогой и поддаются студентов. Таким образом, эта методика может быть использована для исследований, а также в учебных целях. Кроме того, незначительные вариации этого протокола должны предоставлять очистку быстро, с высоким выходом нейронов от других, чем ДРГ источников. Например, эта процедура может быть изменен, чтобы обеспечить нейронально ENRiched культуры из других тканей, таких как эмбрионального переднего мозга или спинного мозга.

Протоколы Иммуноцитохимическая были оптимизированы для этих диссоциированных нейронов культур и подробно описаны здесь. Процедура двойного иммуноцитохимии против нейронной молекулы клеточной адгезии (NCAM) и β1 интегринов предоставляется. Данные, полученные от этих иммуноцитохимических методы были использованы для изучения пространственной кучность и интенсивность нескольких молекул в культивируемых нейронов ^8,16.