Isolamento e Cultura della dissociato neuroni sensoriali da embrioni di gallina

I neuroni sono cellule complesse che portano le informazioni essenziali per una varietà di funzioni, tra cui la sensazione, visione, movimento del motore, l'apprendimento e la memoria. Unico da altri tipi di cellule, i neuroni si estendono i processi braccio-come, chiamate assoni, per formare autostrade neurali essenziali per la comunicazione. Durante lo sviluppo specializzata vani situati alle estremità degli assoni in crescita, chiamati coni di crescita, navigare attraverso un concerto di segnali extracellulari per condurre l'assone alla sua destinazione appropriata. I meccanismi molecolari complessi che sono alla base della crescita del cono di navigazione non sono pienamente compresi. Per comprendere meglio questi meccanismi, i ricercatori hanno utilizzato modelli di coltura cellulare per studiare i neuroni in vitro un ambiente definito e semplificato. Studiare i neuroni in coltura ¹ ha portato a significativi progressi nella nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali tra cui: la differenziazione neuronale ^2, la dinamica del citoscheletro, endocitosi e traffico, dendriteregolazione ^3,4, la rigenerazione assonale ^5, e delle condizioni cliniche, come neuropatie ^6. Inoltre, i neuroni in coltura sono altamente suscettibili di una vasta gamma di tecniche di ricerca tra cui immunocitochimica, cellulare superficie co-immunoprecipitazione, Western blot, trasfezione, RNAi, e l'imaging dal vivo come l'analisi Timelapse del cono di crescita motilità. Così, coltura neuroni primari è un approccio potente per chiarire numerosi aspetti della biologia cellulare dei neuroni.

Il modello di coltura cellulare fornisce investigatori con un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e variabili. Ad esempio, il substrato su cui sono placcati neuroni (e crescono su) può essere facilmente manipolato. Qui, forniamo istruzioni dettagliate per la generazione di due substrati distinti, uno con una bassa concentrazione laminina-1 e l'altro con saturazione concentrazioni di laminina-1. Sorprendentemente, concentrazioni diverse di una stessa molecola può avere effetti drammaticisullo stato interno dei neuroni e la loro composizione superficie cellulare. Ad esempio, i livelli intracellulari di cAMP e superficiali livelli di integrine sono significativamente differenti nei neuroni placcato su questi due substrati ^7,8. Ulteriori studi hanno dimostrato che altre molecole, comprese fibronectina e proteoglicani condroitin solfato, impatto l'espressione di molecole di superficie cellulare e motilità neuronale ^7-11. Inoltre, molecole solubili quali neurotrofine e neurotropins concernono anche la composizione della membrana cellulare e motilità neuronale ^12-16 e può essere facilmente e accuratamente manipolata in un modello di coltura cellulare.

Qui, descriviamo i metodi per isolare e cultura dissociate neuroni sensoriali provenienti da embrioni di pollo. Questa procedura è stata utilizzata per fare progressi significativi nella neurobiologia, tra cui l'estensione assonale ^{5,7,8,10,11,16-21} ed è stato modificato da una procedura volta a isolare le cellule gangliari ^22. Ci sonodiversi vantaggi di questo approccio. In primo luogo, molte caratteristiche del pulcino ganglio della radice dorsale (DRG) sviluppo sono ben caratterizzati compreso il periodo di tempo per la nascita, l'estensione assonale, e profili di espressione proteica ^2,23-28, fornendo così una base istruttivo su cui costruire informativo de esperimenti in vitro. In secondo luogo, dissociate colture neuronali consentono al ricercatore di studiare più direttamente i neuroni rispetto ad approcci alternativi utilizzando espianti intatti DRG (che contengono i neuroni e le cellule non neuronali) e / o colture miste contenenti sia i neuroni dissociati e le cellule non neuronali. In terzo luogo, la procedura qui descritta è semplice, poco costoso e suscettibile di studenti. Pertanto, questa tecnica può essere utilizzata per la ricerca e per scopi didattici. Inoltre, le variazioni minori di questo protocollo dovrebbe permettere di purificazione veloce, ad alto rendimento di neuroni da fonti diverse DRG. Ad esempio, questa procedura può essere modificata per fornire neuronally enrculture iched da altri tessuti come il prosencefalo embrionale o del midollo spinale.

Protocolli Immunocitochimica sono stati ottimizzati per queste colture neuronali dissociate e sono descritte in dettaglio qui. È prevista la procedura di doppia immunocitochimica contro la molecola di adesione neurale cellulare (NCAM) e integrine β1. I dati generati da questi metodi di immunocitochimica sono stati utilizzati per esaminare il patterning spaziale e l'intensità di diverse molecole nei neuroni in coltura ^8,16.