빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조
Summary
양성 혈액 배양에서 빠른 박테리아 펠렛 제제는 MALDI-TOF에 의해 식별, 그람 염색, 항생제 감수성 시험 및 PCR-기반 테스트와 같은 애플리케이션을위한 샘플로서 이용 될 수있다. 결과는 급속 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하기 위해 임상에 통신 될 수있다.
Abstract
혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 균혈증 고통받는 환자의 성공적인 결과는 최적의 항생제 치료를 안내 할 수있는 감염원의 빠른 식별에 따라 달라집니다. 긍정적 인 혈액 배양에서 그람 얼룩의 분석은 신속하게 실시 이미 크게 항생제 처방에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 감염원의 정확한 식별은 여전히 최적의 치료 대상을 설정할 필요가있다. 여기서 이러한 디스크 확산 분석에 의한 MALDI-TOF MS, 항생제 감수성 검사 (AST)에 의해 식별 또는 자동화 AST 시스템과 같은 여러 가지 에센셜 하류 애플리케이션 용 시료로 사용 될 수있는 양성 혈액 배양에서 간단하고 빠른 박테리아 펠렛 제제를 제시 그리고 자동으로 진단 검사를 PCR 기반. 혈액 배양 박테리아 펠릿에 직접 적용이 다른 식별 및 AST 시스템의 성능은 매우 SI이며성능 밀라 (milar)는 일반적으로 한천 플레이트에 성장 고립 식민지에서 얻을. 종래의 방법에 비해 박테리아 펠릿 신속한 취득이 크게 식별 및 AST 모두를보고하는 시간을 감소시킨다. 따라서, 다음과 같은 혈액 배양 양성, MALDI-TOF에 의한 식별은 8 내에서 각각 18 시간, 자동화 된 AST 시스템 또는 디스크 확산 분석에 의해 AST의 결과 반면 미만 1 시간 이내에보고 할 수 있습니다. 마찬가지로 신속한 PCR 기반 분석의 결과는 임상의에게 균혈증 리포트 다음, 2 시간 미만을 통신 할 수있다. 함께, 이러한 결과는 혈액 배양 박테리아 펠릿 신속한 준비 식별 및 AST 턴어라운드 시간에 따라서 혈류 감염으로 고통받는 환자의 성공적인 결과에 상당한 영향을 미치고 있음을 보여준다.
Introduction
입원 환자의 혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 따라서, 감염 혈액과 관련된 사망률은 입원 환자의 37 %로 약 14 %에서 관찰되며, 중환자 실 환자의 1 ~ 35 %로 증가 할 수 있습니다. 감염원의 신속한 식별 최적 항균 치료를 안내와 항균 치료 4,5의 성공적인 결과를 증가시키는 중추적이다. 양성 혈액 배양에서 그람 얼룩의 신속한 분석은 이미 항균 요법 6,7하지만 감염원의 정확한 식별 적응에 큰 영향을 갖는 환자에게 가장 적합한 항생제 치료를 제공해야한다. 예를 들어, 다른 항생제 치료법은 장내 및 그람 염색으로 구별하기 어려운 구균 균혈증 다음으로 구현되어야한다. 마찬가지로, 종의 식별 레프엘은 8-락탐을 β하기 위해 증가 된 저항성을 염색체의 AmpC 유전자를 코딩하는 그람 음성 장내 세균을 검출하는 데 필요합니다.
긍정적 인 혈액 배양으로, 기존의 진단 방법은 생화학 검사, 다른 선택 배지에 성장과 자동화 된 미생물 식별 시스템을 포함한 다양한 방법으로 추가 배양 전에 식별 몇 시간을 필요로 다른 한천 접시에 감염원을 배양하는 것입니다. 종래의 진단 방법의 결과 시간은 약 1-3일이다.
미생물의 신속한 식별을위한 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분석 (MALDI-TOF) 기술의 출현은 신속 양성 혈액으로부터 직접 또한 아가 플레이트상에서 성장한 콜로니로부터 미생물하지만을 식별하는 새로운 도구를 제공했다 문화 (그림 1) 9-12. 목혈액 배양에서 감염원을 확인하기 MALDI-TOF의 전자의 사용은 크게 몇 분 대신 전통적인 방법에 의해 요구되는 시간과 일에 결과 시간을 단축하고있다. Croxatto 외. (13)에 의해 논의 된 바와 같이, MALDI-TOF 식별 효율은 미생물의 순도 및 양을 포함하여 다른 매개 변수에 의존한다. 이 두 기준은 쉽게 한천 플레이트에 성장 이산 식민지에서 얻은하지만, MALDI-TOF 식별을 방해 할 수있는 여러 세포와 단백질 구성 요소를 포함하는 혈액 배양 등 복잡한 시료에서 세균 농축 및 정제를위한 사전 분석 치료를해야합니다.
혈액 배양에서 다양한 미생물 '분리 방법이 세균 추출 9,14, 혈청 분리 방법 10 사포닌 또는 다른 중성 세제 방법을 포함하여 다수의 연구에서 사용 된, 용해 원심 분리 방법 12 </s까지> 등 sepsityper 키트 상업적으로 솔루션을 제공합니다. 우리의 세균학 진단 실험실은 MALDI-TOF에 의한 박테리아와 효모의 빠른 식별 및 자동 식별 시스템 (그림 2) 15를 허용 염화 암모늄 적혈구 – 용해를 기반으로 간단한 혈액 배양 세균 펠렛 제제를 개발했다. 이 혈액 문화 펠릿 준비 또한 그람 염색 등의 직접 다운 스트림 애플리케이션을위한 샘플을 제공, 같은 메티 실린 내성 Staphyloccocus 구균의 신속한 검출 (MRSA)에 대한 POCT-PCR들과 함께 항생제 감수성 검사와 같은 자동화 된 PCR 기반의 진단 테스트 자동화 된 AST 시스템 및 / 또는 한천 플레이트에 디스크 확산 분석 (그림 3)에 의해.
Prod'hom 등에 의해 설명 된 바와 같이이 작품에서, 우리는 혈액 배양 세균 펠렛의 제조를위한 여러 단계를 설명합니다. 15 (그림 4). 우리는 또한 탈 것서기관 혈액 배양 펠릿에서 수행 할 수있는 주요 응용 프로그램의 세 가지에 대한 프로토콜 : 자동 장내 세균에 대한 시스템 16 및 포도상 구균 및 자동 PCR-와 MALDI-TOF 15, 식별 (ID) 및 항생제 감수성 검사 (AST)에 의해 확인 MRSA (17)의 검출에 기초하여 진단 테스트.
Protocol
Representative Results
Discussion
종래 양성 혈액 배양 진단 방법에 비해, 염화 암모늄 용해 원심 분리 방법을 이용하여 세균 펠렛의 빠른 획득은 24 시간 및 48 시간에 24 의한 AST를보고 할 때 (도 1 및 16에 의해 식별을보고하는 시간을 단축 3).
적절한 항생제 치료의 도입은 빠른 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 향상시키기 위해 중요한 것이다. 따라서, 약 8-16 시간에서 얻은 빠?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 실험실에서 기술을 구현하는 그들의 도움을 로잔의 대학 병원 센터의 세균학 연구소의 기술자 감사합니다.
Materials
| 20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
Referências
- Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
- Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
- Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
- Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
- Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
- Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
- Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
- Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
- Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
- Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
- Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
- Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
- Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
- Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
- Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
- Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
- Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
