的vibratome切片小鼠视网膜准备感光文化

注：该程序是经伦理委员会达尔文大学的皮埃尔和玛丽·居里（CE5 / 2009/048） 1.准备明胶溶液，仪器的vibratome，文化传媒与文化板块准备至少一天实验前20％的明胶溶液。 引擎盖下，加入500μl庆大霉素[10毫克/毫升]中，以500毫升一瓶含CO 2独立的媒体（CO 2 -i）。 在一个单独的烧杯中，在95℃的加热块上添加20毫升二氧化碳-I的（从步骤1.1.1）和加热并不断搅拌15分钟。观察的颜色变化到黄色，表明溶液已准备好以供进一步使用。 权衡4克明胶和逐渐差具有增加的搅拌和加热上述制备的溶液（ 步骤1.1.2）在95℃下45分钟，以得到黄色溶液。允许明胶溶液下冷却罩为大约5分钟。 倒入4毫升明胶溶液放入直径35 mm的培养皿中没有引入气泡。保持培养皿在21℃30分钟。盖上塑料薄膜的菜肴，把菜肴倒挂。任选地，保存菜肴，在4℃下使用前长达2个月。 制备4％的明胶溶液。 引擎盖下，在42℃的加热块上添加25毫升的CO 2 -i介质中的无菌的塑料容器，和热。从加热块中取出介质，并逐渐加入1g明胶到热介质，搅拌。快速返回容器中的加热块（42℃）上，并在此过程中保持温暖。 设置-起来的vibratome设备： 删除包含储存于4℃的20％的明胶溶液中的菜肴。切断与手术刀明胶。翻转明胶切片，贴在的vibratome的使用一滴s的黑盘支持UPER胶水。 打破刀片成两半，并插入一个半到的vibratome控股插座。将黑色的支持光盘上的vibratome设备。打开黑色旋钮右侧。固定在所述的vibratome的头部的保持插座。加的CO 2 -i介质足够量中的vibratome罐以覆盖明胶块。 接通的vibratome切成阿胶块三个100微米片。继续进一步使用的阿胶块。 制备40毫升培养基： 罩下制备的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）胎牛血清（FCS）的10％。制备1mg / ml的聚-D-赖氨酸用磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4的。 在一个96孔板中，添加聚-D-赖氨酸的2微克/厘米2涂覆的孔的底部。在5％的CO 2培养箱中孵育该板45分钟，在37℃。孵育后，除去PBS，并替换为200μl的/孔的DMEM和地点再次在37℃下在5％CO 2培养箱中在使用前。 2.解剖整个视网膜的剜除鼠标： 根据欧洲指令六十三分之二千〇一十牺牲小鼠：通过颈脱位。切头弯剪刀，并将其放置在一个直径100毫米的培养皿经消毒眼用消毒后。 去除眼部受切片非常仔细地使用弯曲的抓地力后，已经脱离了视神经​​。然后把双眼含无菌CO 2 -i培养基21°C 35毫米的培养皿。 取出视网膜： 使一个孔在眼睛肢用18G的针的帮助下的水平，以便能够引入剪刀到眼睛的地球。介绍孔内直剪刀小心切割下虹膜，巩膜上眼球的所有周边删除睫状体。 <li>取下角膜和透镜，并保持在眼睛的后房与视网膜邻接的巩膜。有两个细交手，除去位于后室内的玻璃没有损坏视网膜。执行四个径向切口（视网膜/巩膜），以允许在视网膜的平坦化。 好转眼球和剥离它作为一个“橙色”。分离从巩膜和视网膜色素上皮细胞（RPE）的视网膜。卸下仍连接在视神经的水平非常仔细地用细弯剪刀视网膜。 分离从朝视网膜的具有两个细把持中心的周边的其余玻璃体。确保所有玻璃体完全除去以使视网膜的扁平化。 切割塑料吸管的末端和视网膜转移到含有CO 2 -i介质与塑料吸管35毫米直径的培养皿。 3.密封平mounte的ð视网膜上阿胶块从的vibratome罐（阿胶块是免费的）30毫升CO 2 -i介质允许平板式视网膜密封-删除20。 用塑料吸管视网膜转移到载玻片上并转移到明胶片朝下明胶片上的感光体前2 -i介质加一滴的CO。 通过轻轻地注入在视网膜和明胶块之间的块的一侧温热4％明胶和同时在另一侧排出暖和明胶附着在视网膜的明胶块。 抽吸4％明胶用巴斯德吸管。等待10分钟，以允许总的密封。加入CO 2 -i中沉浸块，完全的刀片。 4.切片视网膜注：该步骤是关键的，得到层感光细胞没有其他视网膜细胞（ 图1）。 从明胶块的顶部开始，切割100微米的连续切片到达视网膜。然后切100 – 内层120微米的部分。根据不同的应用，该层可能会被丢弃或保存在液氮中。确保的vibratome的速度很慢（在1或2）内层或光感受器的层的切片中。 执行对应于所述内和外视网膜之间的界面处的视网膜的中间体15微米的部分。遵守本节在显微镜下。缺乏血管表明外视网膜已经达到。 切割200微米的外视网膜（感光层）与明胶，并将其转移到充满用3ml的CO 2 -i介质的35毫米直径的培养皿中。保持它在冰上，直到所有的视网膜的所有感光层段获得。 5.进行分离感光细胞就拿菜（ES）含有感光层（多个），并把它（它们）的培养箱，在37℃下进行10分钟。 利用镊子轻轻地从明胶分离感光层和在一个新的培养皿填充用3毫升林格氏溶液传送。重复每个感光层准备这一步（5.2）。 孵育2个单位的木瓜蛋白酶的用25微升的活化剂溶液（1.1毫摩尔EDTA; 5.5毫L-半胱氨酸; 60μMβ巯基乙醇）在5ml的聚丙烯无菌管中并在5％CO 2培养箱孵育它30分钟，在37℃下。木瓜蛋白酶的激活是在37℃下实现的。在此孵育后，切断感光层分为2 mm 2的片（ 未太小 ），并且这些片转移到5ml的试管中。 用1.5ml的溶液林格氏溶液，随后通过重力沉降漂洗视网膜两次。除去从与试样管的所有剩余林格氏液。 添加475微升林格氏液含有活化木瓜蛋白酶和混合管。添加这种溶液到含有视网膜管。 孵育视网膜20分钟的管中在37℃在5％CO 2的培养箱中培养。停止加入在DMEM1毫升10％FCS中的反应。添加脱氧核糖核酸酶25 U I（DNA酶I），以消化DNA从死亡细胞。使用1毫升移液管小心地均化的细胞悬浮液。旋转，在50×g离心6分钟，在室温。 弃去上清液，以除去血清的痕迹，并与补充添加DMEM培养基（见表的具体reagents_equipment）到细胞沉淀，并仔细重悬细胞悬液与1毫升吸移管。旋转，在50×g离心6分钟，在室温。重复此步骤（5.7）一次。 6培养感光细胞的小鼠在PN8所述感光层含有用这种技术大约1至1.5百万个细胞。种子光感受器细胞以1×10 5个细胞/ cm 2在培养板上用培养基和培养在5％CO 2培养箱将细胞5天，在37℃。在第5天，进行免疫化学和通过抗体的供应商提供的免疫印迹研究以下方法。 注：步骤停止文化和初步测试是在参考21描述。