一<em>在体外</em>成年小鼠肌肉，神经准备留学肌肉传入放电的放电特性

适当的国家和机构伦理应该进行动物实验前获得。 1，拆卸EDL肌肉和神经的称量并深深麻醉成年小鼠吸入异氟烷用5％异氟醚蒸发器加上1.5升/分钟的氧气流量或钟形罩，底部异氟醚浸泡的棉花。 确保鼠标是深度麻醉，不给脚趾捏回应。快速斩首使用大，锋利的剪刀或断头台。 请通过用剪刀肋骨下腹正中切口和除去内脏。 通过抓住从颈部区域的皮肤和拉过去脚部皮肤的动物。 通过切割上述的臀部除去腿部和放置面皮腿与冷藏（4℃）的培养皿，carbogenated（95％O 2，5％CO 2）低钙，高镁的碳酸氢盐缓冲的盐水溶液周转箱宁以mM：128氯化钠，氯化钾1.9，1.2 KH 2 PO 4，26的NaHCO 3，0.85氯化钙 ，16 6.5 MgSO 4干燥，和10葡萄糖（7.4±0.05的pH）。低钙，高镁溶液在解剖抑制突触传递。 将腿背侧的菜和脚的腿和臀部向下用针或昆虫针，使得膝关节和踝关节是在一个90°的角。放置在脚的每一端与一个销上的每个前侧和后侧的大腿的销来固定到位的组织。 使用Castroviejo弹簧剪刀，抬起肌的大腿上的顶层，并切割以暴露坐骨神经直接下方的中线。坐骨神经位于正下方的顶端肌肉层和运行从其出口股骨附近的臀部上方，直到其分支成刚膝关节前腓总和胫神经。 删除上述坐骨神经肌肉，直到POINT在此深腓神经的分支潜入拇长屈肌（FHL）肌肉可见。 使用＃55钳子，解剖周围腓分支的结缔组织，从腓肠肌和比目鱼肌，这是对内侧胫骨释放它。切断腓肠肌和比目鱼肌的肌腱和小心地从神经下将其删除。 除去在胫骨的侧面浅表肌肉以暴露三个不同的腱束在踝关节，从内侧到外侧：FHL，EDL，和胫骨前肌（TA），与EDL隐藏在TA下方。 切助教肌腱在踝关节，从EDL解除助教起来了，并切断肌肉膝盖附近将其删除。 切FHL肌腱在脚踝，将其返回到到达那里的神经进入FHL的区域。切略低于该点并删除FHL肌肉〜2/3。 切断坐骨神经尽可能靠近髋关节为POSsible，轻轻去掉所有的神经分支除外腓深神经分支。 切筋EDL在两个用大弹簧剪刀踝关节和膝关节。 使用锋利的剪刀，从周围组织中取出的EDL，剩余FHL和神经通过在膝关节切削穿过胫骨和中途的大腿。切去其余的胫骨，这样就在EDL中，信望爱和神经的一部分保留下来。 2，安装EDL肌肉和神经进入组织浴（图1A） 在实验开始之前，准备的组织浴中。不断灌注同浴含氧（100％O 2）合成的组织间液（SIF）含（单位mm）123氯化钠，氯化钾3.5，0.7 硫酸镁 ，1.7 磷酸二氢钠，2.0 氯化钙 ，9.5 NAC 6 H 11 O（葡糖酸钠），5.5葡萄糖，7.5蔗糖和10 N -2 – hydroxyethylpiperazine- N'-2 -等hanesulfonic磺酸（HEPES）; pH值7.4±0.05 17。 15-30毫升/分钟的流速被推荐。显示的是25毫升容量与固定在浴缸的底部，有一个组织安装后和安装的力和长度控制器（约计浴缸尺寸2刺激电极市售洗澡8.5厘米×3厘米×1厘米;适合的产品。参照表的材料/设备）。 用剩余的FHL组织处理隔离肌肉神经，并将其放入组织浴。放置一小片SYLGARD对培养皿的底部，并用驱虫针通过剩余FHL组织稳定的肌肉。 用6-0丝线缝合扎两个筋并加盖一端到组织后，其他的力和长度控制器的控制杆臂（见表材料/设备规范）。使用最小的缝线长度是可行的。取出昆虫针和SYLGARD你绑筋后。注：为便于连接到所述杠杆臂的小片金属丝可以弯曲成“J”形钩和固定到该杆臂与环氧树脂。缝合线可以被连接到导线，而不是拧入于该杆臂的小孔。 请从SA的16玻璃吸电极先用玻璃微拉马（热火= 286，拉= 0，速度= 150，时间= 200）;突破尖端背部和手动磨它放在磨刀石，直到有大约3毫米的锥形。使用microforge尖端融化到10之间所需的尖端内径- 100微米取决于神经的一个希望从取样的区域（ 见图1B，1C的电极原理图和表格材料/设备产品信息）。 填写预制玻璃吸电极的内银线与SIF。 抽吸神经的切断端插入电极和连接到差分放大器的正端口。包裹在电极与氯化的银导线连接到探头的负极端口。从浴缸到探头的接地端口上运行的第二氯化的银线接地的SIF洗澡。另外地灌注管法拉第笼在多个点，以减轻通过灌注泵推出的电噪声。 刺激通过安装在该组织浴中的肌肉的任一侧以诱导肌收缩，​​电极的肌肉。可选地放置在神经的切断端部的刺激电极。增加刺激电压，直到峰值收缩力观察，然后增加电压通过一个额外的15％，达到超强的电压（0.5毫秒脉冲宽度）。继续抽搐收缩在超最大电压，用10秒的休息在中间，但改变肌肉的长度，直到峰值收缩力达到找到肌肉的最佳长度（L O）。所有的长坡道和震动将开始与肌肉在这个冷日。 允许肌肉的神经制剂保持在该浴中的至少1小时，随后的数据采集之前，以允许所述组织，以达到熔池温度和正常的突触传递，以恢复以下清扫低钙溶液。 为了收集数据，在比室温等的温度，将温度探头到附近的肌肉组织浴。慢慢地由穿过组织浴底板泵送加热的水使浴加热到所需温度。环绕SIF水库粘土微波炉加热垫，以帮助保持稳定的温度。 3，数据收集要确定一个传入的梭传入，在一个0.5毫秒超强电压刺激产生重复发表抽搐收缩每秒一次记录的神经元活动。注：肌梭传入应抽搐收缩18,19（ 图2）期间暂停。 使用DATA采集软件适用长度的变化以不同的速度和不同的长度。使用自定义脚本来自动完成这个任务（见补充信息的脚本和方向如何自定义给出的延伸截图）。应用4秒的斜坡和保持伸展为2.5％，5％，7.5％L O伸缩长度为20，40，或60％L O / 15秒的拉伸速度。注：请参阅具体的力量和长度控制器所需的电压 – 毫米换算系数使用手册。 在实验结束时，确定肌肉健康在24℃下使用最大等长强直收缩（500毫秒列车，120赫兹串频率，0.5毫秒的脉冲宽度，超最大电压）。峰值收缩力比较先前报道的值（〜24牛顿/厘米2 9,20）。