解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

ショウジョウバエの雄で精巣は、既に胚に形成されており、幼虫の段階で体腔内に存続されています。 3齢幼虫ショー小さく丸い精巣将来の色素細胞の層に囲まれ、脂肪体組織（ 図2A）に埋め込 ​​まれた。成体雄ハエにおける精巣生殖器ディスクと色素層24に由来する筋細胞の層によって覆われる長く、コイル状のチューブである。興味深いことに、幼虫の精巣は減数分裂前期に対応する一次精母細胞の段階まで、前減数分裂および減数分裂のステージのみ生殖細胞を含有する23（ 図1も参照）。雄の生殖細胞の最初のコホート蛹殻形成中に減数分裂を通過する。 約 24時間のAPFで、細長い鞭毛と減数分裂後の段階では、既に開発し、すべての核がヒストンH2AvD-RFP（ 図1および図2（b））が含まれています。精子細胞のいずれもtは受けていない彼なしProtamineB-eGFPの信号としてHPスイッチは、蛍光顕微鏡（ 図2C）によって検出することができる。多くの場合、この段階で解剖し、精巣は、オイルを数滴（ 図2C、矢印）に脂肪体細胞の凝集体または1を彷彿とさせる可変サイズの自動蛍光構造を含む。精巣内のこの構造は、位相差顕微鏡でも見えている。これまでに、文献では、その性質のいずれかの記述を見つけていない。 36時間APFで切開し精巣が長く、場合によっては既に（ 図2D）カールし始めるようである。彼らはすでに性器成虫盤23,24から成長して生殖管の組織に付着している。さらに、それらはしばしばProtamineB-eGFPの信号（ 図1および図2D、矢印）によって示されるように、HPスイッチを超えた最初の精子細胞を含んでいる。 48時間APFでは、精巣はさらに細長い持ち、明確でカーリングを開始近位端。プロタミン陽性の核を有するいくつかの生殖系列嚢胞（ 図2E、矢印）見えるようになる。 24時間APFで解剖し、精巣は24時間の培養で維持されている場合、それらは無傷のハエのように細長くしない（ '図2Dを比較し、 図6Aと図2E）。これはおそらく、通常はその後方先端23,29で精巣と連絡を開発する生殖管から送られた位置と成長シグナルの欠如によるものである。発生期の筋管が精巣24に性器ディスクから移行できないので、さらに、精巣鞘の筋層が発達しない。精巣鞘内でこのような状況は、単に薄い顔料層は、ない内生殖細胞の開発が増えてエンベロープ培養液中で十分に成長していないよう。しかし、生殖細胞は、分裂を成長させる、および精巣鞘から独立して分化する。したがって、以上の36時間後培養中のrは、初期の精巣が頻繁に破裂し、さらなる開発が観察されない。しかし、より短い時間枠内では、 図3A -3 C（また補足ビデオ1を参照）によって証明されるように、培養物中で現像エキソビボ全精巣のライブ画像を経時的に記録することができる。 約 45時間のAPFで解剖し蛹の精巣は、6時間培地中でインキュベートし、5分毎に画像化した。この時間枠内では、精子細胞のいくつかの嚢胞は、HPのスイッチ段から出てくると明るいProtamineB-EGFP信号（ 図3A '-3℃、白抜き矢印）を示している。 上述したように、 ショウジョウバエの精巣における雄性生殖細胞が相互接続された細胞の同期化されたバンドルとして開発する、という嚢胞1。 図4（a）は、約24時間のAPFで蛹の精巣から切除嚢胞の概要を示している。前減数分裂の段階、減数分裂の段階、早期減数分裂後の段階で、また前にHPのスイッチに細長い核を早期カヌー段階で嚢胞は（ 図1および図4（b）-4 E）見つけることができます。孤立した嚢胞は非常に脆弱であり、慎重に処理する必要があります。嚢胞のエンベロープを形成する2つの体細胞は、容易に機械的に破壊することができる。生殖幹細胞は生存し、 生体内で 30 の体細胞嚢胞細胞の遺伝子除去した後に分割することを継続する能力を持っている。それは、 インビトロで 、それらの体細胞エンベロープから分離16細胞期の胚細胞は、さらに19を開発し、分化することが報告されている。確かに、私たちは非常にまれではあるが、おそらく後期精母細胞が破壊嚢胞細胞と減数分裂を完了した私たちの文化系で気づいた。最も頻繁には、これらの破壊された嚢胞が開発を中止した。提示されたプロトコルに続いて、いくつかのケースでは、完全な嚢胞かもしれないがdevの72時間の最大のためのElopはex vivoで培養中の培地。しかし、嚢胞の合理的な数は、インキュベーションの48時間まで生き残ることを観察した。この時間枠内では、培養された嚢胞が減数分裂後までと同様に、HPのスイッチ12を超えた後期カヌー段階まで、ヒストンベースクロマチンと丸い核の段階から精母細胞から発生することができます。例えば、精母細胞が減数分裂に入るので、これは（ 図5及び補足ビデオ2）、精子形成に不可欠なプロセスをライブイメージングを可能にします。この実験のために、RFPタグ化ヒストンバリアントH2AvDは染色体マーカーとして使用した。精母細胞は、 インビボ 31 に約 3日間にわたって延びている。したがって、減数分裂を記録するために、私たちは目に見えてクロマチン凝縮（ 図5A、領域2）を開始した精母細胞とシストを選びました。減数分裂は、精母細胞で開始嚢胞の一方の側にしてから、残りの精母細胞に波を次の（領域2から領域1に、図5（a）の、また、 補足ビデオ2を参照）。クロマチンの凝縮はすぐに明るいスポット（ 図5A、領域2）として表示されている動きの速い染色体につながる。 30分後、この地域の最初の精母細胞が分裂終期（ 図5B、矢印）に既に存在する。若い領域1の染色体は中期板20分後（ 図5C）に配置します。彼らは完全な終期と（ 図5D）の約15分後に細胞質分裂を受ける準備ができています。分裂後期には、終期、および細胞質分裂は、この記録（ 補足ビデオ2）における約 10分間続いた。 哺乳類では、同様に、ショウジョウバエの場合と同様に、ヒストンH4のアセチル化の顕著な増加は、減数分裂後の時にヒストンの除去とHPのスイッチの開始をマークし精子形成6,11。それは、このエピジェネティック修飾が必須成分またはHPスイッチ10,32の発生プログラムの偶数トリガーであることが提案されている。以前は、私たちは阻害剤が減数分裂後の段階で12時にヒストンH4のアセチル化レベルに影響を与えるように帽子とのHDACを標的にして培養液中でショウジョウバエの蛹の精巣を治療した。これらの薬理学的アッセイでは、ヒストンアセチル化は、プロタミンベースクロマチンとステージにヒストンベースのクロマチンとの段階から精子形成の進行に必須であることがわかった。 図6および図7は、蛹の精巣でのHATを標的とするアナカルド酸を用いた薬理学的ア ​​ッセイの代表的結果を示す。 24時間APFでの精巣はH2AvD-RFPとProtamineB-EGFPを発現しているハエ株から切開した。 ProtamineB-EGFPタンパク質は、これらの初期の蛹精巣（ 図6AおよびB）には存在しなかった。 24時間後培養中のrは、制御精巣は、まず嚢胞は、HPスイッチ（ 図6A '、オープン矢印）を超えて開発したことを示したProtamineB-EGFPシグナルを示した。これは、150μMアナカルド酸（ 図6B '）で処理された睾丸とそうではありませんでした。精巣スカッシュ製剤および免疫蛍光分析は、より詳細な情報（ 図7）を提供しています。未処理対照では、比較的大きい一次精母細胞の核は、 ショウジョウバエの主要な染色体（4Cレベル）（ 図7A、列1）に対応する豊かな染色されたDNAの3つの領域のその特徴的パターンによって認識することができる。ヒストンH4のアセチル化は、この段階（ 図7B、列1）で明らかに検出可能である。減数分裂後の最初の段階は、小核ステージとして知られており、かなり大きな、丸い核によって特徴付けられる（ 図4Cを参照して、図7に示されていない）。 図7に示す次の段階は、鞭毛の成長およびすでに初期の段階（ 図7A、列2）よりもはるかに小さく、ヒストンH4アセチル化のほぼ検出不可能なレベルに非常に低い示し生殖細胞核、ラウンド形状で識別され（ 図7B、列2）。円形その後伸長した（ 図7A、列3）、およびヒストンH4のアセチル化を再度（ 図7B、第3欄）は、明らかに検出可能である。精子細胞は、次にHPの切り替えが行われると、ヒストンがプロタミンで置換されたカヌー形のステージに到達する（ 図7A – 7 C、カラム4および5）。カヌー段階、protaminated核以下次いで、さらに成熟した精子（ここでは図示せず）に非常に細い針状に細長い。 アナカルド酸で処理精巣の精巣スカッシュ製剤は、（ 図7Dを異なる結果を示した</ strong>の- 7 F）。アナカルド酸で処理された生殖細胞におけるクロマチンは、より未処理のコントロール（ 図7D、処理され、7A、コントロールと比較）よりも凝縮されたようであった。免疫蛍光分析は、H4のアセチル化は、アナカルド酸（ 図7E）で処理された生殖細胞の核内で非常に減少、あるいは存在しないことを明らかにした。ヒストンのアセチル化を欠いているクロマチン領域は頻繁に抑圧的な構造33を示しているが、それは、高アセチル化ヒストンが開いたクロマチンの領域に関連することが知られている。したがって、アナカルド酸で処理することは、治療生殖細胞核のクロマチン構造に影響を与えたことは驚くべきことではない。重要なことは、後期カヌーステージのかを超えていないプロタミン陽性の核が治療精巣（ 図7F）で同定されなかった。このように、私たちのデータは精子があちこちに進行する。ハット活動が不可欠であるという考えと一致しているプロタミンベースのクロマチンステージにヒストンベースのクロマチンをメートル。 ショウジョウバエの精子形成の図1。概要。左側のパネルには、個別化された精子幹細胞からの生殖細胞の発達における一連のステージが表示されます。模式図は、生殖細胞の特性核の形態を示す。一つの精原細胞は1嚢胞で16相互接続された精母細胞を生成するために分割します。この段階で減数分裂後の開発に必要な転写物のほとんどは、生産翻訳抑制、および保存されます。転写活性の大部分は、減数分裂へのエントリで終了します。クロマチンにおけるヒストン·ツー·プロタミンスイッチは初期および後期カヌーステージとの間で行われる。ヒストンベースのクロマチンとのステージが高い赤で点灯。プロタミンベースのクロマチンとのステージは緑色でハイライトされています。右側のパネルのバーは、生殖通常幼虫の途上精巣で見つけることができる細胞、蛹殻形成（APF）の後に、約 24および36時間で蛹と成虫の段階を示している。 発達の異なる段階で2 ショウジョウバエ精巣図。 （A）は第三齢幼虫（L3）のわずかに押しつぶさホールマウント精巣の位相差画像。前減数分裂と減数分裂だけのステージを求めることができる。精原細胞は、ハブ地域（アスタリスク）の下の前歯の先端に制限されています。残りの精巣は、精母細胞（白矢印）が充填されている。 約わずかに押しつぶされた精巣の（B）の位相差画像蛹殻形成後24時間（APF）。精母細胞（白矢印）に加えて、精巣は成長鞭毛（ダブルオープン矢頭）でのステージを伸長ラウンド核および精子細胞で、小核のステージ（オープン矢印）に精子が含まれている（C – E）。ホールマウント蛹精巣に発現H2AvD-RFPし、 約 24時間のAPFで解剖しProtamineB-EGFP（位相コントラストおよびEGFPおよびRFP蛍光画像のオーバーレイ）。（C）蛹精巣。のグループと約 48時間のAPFでのアローヘッドは、推定脂肪体細胞の自家蛍光をマークします。D）蛹の精巣を、約 36時間のAPFで解剖し最初ProtamineB-EGFP陽性シスト（矢印）が表示されます。（E）蛹精巣ProtamineB-EGFP陽性嚢胞（矢印）。すべての図形の部分では、アスタリスクは、ハブ地域を示している。スケールバー：100μmである。ANK ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ex vivoで成長して蛹精巣におけるヒストン·ツー·プロタミンスイッチの図3。ライブイメージング。蛹殻形成（APF）の後、約 45時間後に培養液に入れH2AvD-RFPとProtamineB-EGFPを発現している蛹精巣の（A）の位相差画像。精嚢は満たされた矢印で示されている。 paragonium（二重矢印）精巣に付着したまま。（A '）（A）に示すよう精巣のEGFPおよびRFP蛍光。オープン矢印はProtamineB-EGFP陽性嚢胞を示している。スケールバー：100μmの（B）の培養液中の2時間30分後に、いくつかのさらなる嚢胞（白矢印）はFRをemergeオム追加の約後、ヒストンからプロタミン移行。（C）培養中の3時間、 すなわち、培養中の5時間29分の合計は、強いProtamineB-EGFP信号とシストのグループ（白矢印）は精巣の近位端に表示されます。また、 補足ビデオ1を参照してください。すべての図形の部分では、アスタリスクはハブ地域を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 発達の異なる段階で生殖細胞の4絶縁型嚢胞図。 （A）は嚢胞は蛹殻形成（APF）の後、約 24時間後に精巣から解剖した。位相コントラストとH2AvD-RFP蛍光（赤）画像のオーバーレイ。スケールバー：100μmである。（B – E）異なる段階の単一嚢胞の倍率は。微分干渉コントラスト（DIC）とH2AvD-RFP蛍光画像のオーバーレイ。スケールバー：小核段階での64ラウンドの精子細胞の20ミクロン（B）16精母細胞の嚢胞（C）嚢胞。小核構造が融合したミトコンドリアから開発し、核（オープン矢頭）の隣にあるDIC画像に表示されます。（D）精子細胞の嚢胞ラウンドH2AvD-RFP陽性の核とし、鞭毛（オープン矢印を長くすることに伴う伸長小核の構造を示している細長い核形状を示す初期のカヌー段階における精子細胞の嚢胞の成長軸糸）。（E）アピカル先端。広範囲に細長い鞭毛は部分的にしか表示されます。 このFの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。igure。 減数分裂を受けて単一の16精母細胞嚢胞の図5。ライブイメージング私はex vivoで H2AvD-RFPを発現し、培養中の嚢胞の。蛍光画像。図示の嚢胞における減数分裂I.精母細胞の特徴的な段階が波状で減数分裂を通過している。（A）染色体凝縮（2）嚢胞の一側核において始まり、矢印の嚢胞（方向を進む）。対向領域における核は、（1）三大染色体をマークするヒストン密集地域は依然として識別できるクロマチン凝縮、それ以前の段階を表している。地域の精母細胞（2）は明るい蛍光スポットとして見える完全に凝縮染色体を、含まれています。（B）30の後0;分、染色体凝縮地域に継続している間領域内の最初の精母細胞（2）、終期（開いた矢印）である（1）〜（C）領域の最後の精母細胞（1）において、染色体（矢印）が配置されている。さらに15分以内に、中期板20分後。（D）で、最後の精母細胞は終期を完了しているように見え、今細胞質分裂（オープン矢じり）を受ける準備ができています。 。また、 補足ビデオ2スケールバーを参照してください。50μmのこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図6アナカルド酸は、培養蛹精巣におけるヒストン·ツー·プロタミンスイッチを阻害する。蛹がexpressi精巣 （（DMSO、ジメチルスルホキシド; 'A、A対照）または150μMのアナカルド酸を添加した培地でNG H2AvD-RFPとProtamineB-EGFPと蛹殻形成後24時間目に解剖し（APF）は、阻害剤を含まない培地中で24時間培養したB、​​B '）。ハブ領域は、星印で示されている。（A、B）いいえProtamineB-EGFP陽性嚢胞は解剖後に観察することができます。（A '）インキュベーションの24時間後に、いくつかの嚢胞がヒストンからプロタミンスイッチとProtamineB-EGFP陽性を受けた嚢胞（オープン矢頭）が観察できる。（B '）アナカルド酸で処理精巣がProtamineB-EGFP陽性嚢胞を発症しない。スケールバー：100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 68 / 51868fig7highres.jpg "幅=" 500 "/> 図7アナカルド酸はヒストンH4のアセチル化および精子細胞のクロマチン構造に影響を与える蛹精巣から精子細胞の核ProtamineB-EGFPを発現している（24時間APF）は阻害剤（A – C）なしで24時間インキュベートのスカッシュの準備を。または150μMのアナカルド酸と（D – F）。 DNAをヘキスト色素（A及びD）で染色した。 H4のアセチル化は、（BとE）免疫蛍光分析した。 ProtamineB-EGFP信号（CとF）でモニタープロタミンの存在。アナカルド酸で処理した後、クロマチンを強く（D）に圧縮表示さ及びH4のアセチル化信号は、完全にすべての精子細胞の段階（E）に低減される。また、アナカルド酸は、処理された精巣は、後期カヌーステージのかを超えていない嚢胞なしProtamineB-EGFP信号（F）を示さない。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 補足ビデオ1。6時間の時間経過イメージングのex vivoでビデオに成長蛹精巣におけるEGFPおよびヒストンからプロタミンスイッチのRFP蛍光を介したライブイメージングは ProtamineB-の有病率の増加によるヒストンからプロタミン推移を示すEGFP陽性嚢胞。画像は5分毎に取得した。詳細については、 図3を参照してください。（ダウンロードの下に「suppl_video_1.MOV」を参照してください）。 補足ビデオ減数分裂を受けて単一の16精母細胞シスト0002ライブイメージングI ex vivoで 。のタイムラプス蛍光イメージング80分かけH2AvD-RFPを発現し、培養中の嚢胞。このビデオでは、減数分裂Iを画像の特徴的なステージが1分ごとに取得した描写。詳細については、 図5を参照してください。（ダウンロードの下に「suppl_video_2.MOV」を参照してください）。