解剖，成像和药物治疗： 果蝇蛹睾丸和单身男性生殖系囊肿的体外培养

已经形成在果蝇雄性的睾丸中的胚胎，并在幼虫阶段仍然存在于体腔。第三龄幼虫显示小的圆形的睾丸被一层未来色素细胞包围和嵌入在脂肪身体组织（ 图2A）。成年雄性果蝇精巢长，盘管，这是覆盖了一层肌肉细胞从生殖盘和颜料层24发起的。有趣的是，幼虫睾丸只包含生殖系前减数分裂和减数分裂期的细胞，直到初级精母细胞阶段，其对应于减数分裂前期（也参见图1）23。雄性生殖细胞的第一队列中puparium形成通过减数分裂。在约 24小时的APF，具有细长的鞭毛减数分裂后阶段已经开发，以及所有的细胞核含有组蛋白H2AvD-RFP（ 图1和图2B）。概无精子的经历吨他的HP交换机作为无ProtamineB-eGFP的信号可以通过荧光显微镜（ 图2C）来检测。频繁，解剖在此阶段睾丸含有可变大小让人联想脂肪体细胞的团块或1的一个自动荧光结构几滴油状物（ 图2C中 ，箭头）。睾丸内该结构也与相衬显微镜可见的。到今天为止，我们还没有发现它在文学性质的描述。睾丸解剖在36小时APF看起来拉长并且在某些情况下，已经开始卷曲（ 图2D）。他们已经附着在生殖道从生殖器成虫盘23,24生长出的组织。此外，它们经常含有超出高压开关的第一精子细胞，由ProtamineB-eGFP的信号（ 图1和图2D所示 ，箭头）所指示的。在48小时的薏仁，睾丸有进一步拉长，并明确在开始卷发近端。几种系孢囊与鱼精蛋白阳性细胞核变得可见（ 图2E，箭头）。 当睾丸 ​​解剖在24小时APF保持在培养24小时，它们不细长作为完整蝇（比较图2D和2E与图6A'）。这可能是由于缺乏通常从显影生殖道在其后侧端部23,29接触的睾丸发送位置和生长信号。另外，睾丸鞘膜的肌肉层不显影因为新生肌管不能从生殖器圆盘迁移到睾丸24。睾丸鞘在这种情况下只薄的颜料层似乎并没有充分生长在文化信封越来越多的发展中国家在生殖细胞。然而，生殖细胞生长，分化，独立于睾丸鞘膜的区别。因此，经过36小时R IN文化，早期的睾丸经常会爆开，再发展没有观察到。然而，在较短的时间内，它可以记录的时间推移的体外活整个睾丸中培养显影的图像，如由图3A -3℃（参见补充视频1）。蛹期睾丸，解剖在约 45小时薏仁，培养在培养基中6小时，拍摄每5分钟。在这段时间内，精子数囊肿从HP交换机舞台崭露头角，并显示一个明亮的ProtamineB-EGFP信号（ 图3A'-3℃，空心箭头）。 如上面所提到的，雄性生殖细胞在果蝇睾丸开发作为互连单元的同步包，命名囊肿1。 图4A示囊肿从蛹睾丸解剖在约24小时的APF的概览。前减数分裂期，减数分裂阶段，早期减数分裂后阶段，也囊肿在早期独木舟阶段之前与惠普开关细长晶核可以发现（ 图1和图4B -4 E）。孤立囊肿是很脆弱的，必须小心处理。形成的囊肿的包络在两个体细胞可以容易地破碎机械。生殖系干细胞具有生存和继续的体囊肿细胞的遗传消融后除以体内 30的能力。已经报道了在体外实验中，16个细胞期的生殖细胞从它们的体壳分离进一步发展和分化19。事实上，我们注意到，在我们的推测后期精母细胞完成减数分裂与破坏囊肿细胞，虽然很罕见的文化体系。最常见的，这些破坏囊肿停止发展。以下所提出的协议，完好囊肿可能在某些情况下，dev的埃洛普体外培养基中最多72小时的。但是，我们观察到囊肿合理数量的存活长达48小时的潜伏期。在这个时间帧，将培养的孢囊是能够从初级精母细胞阶段到发展直到减数分裂后，以及从圆形核阶段与组蛋白为基础的染色质，直到HP以外已故独木舟级开关12。这允许在精子发生生命过程的实时成像，例如，精母细胞进入减数分裂（ 图5和参考视频2）。对于这个实验中，RFP标记的组蛋白变体H2AvD用作染色体标记物。初级精母细胞阶段约 3 天 ， 体内 31延伸。因此，为了记录减数分裂，我们选择孢囊与已明显开始染色质凝聚（ 图5A，区域2）精母细胞。减数分裂开始在精母细胞对囊肿的一侧，然后如下在其余精母波（ 图5A中从区域2到区域1中，也见参考视频2）。的染色质缩合很快导致快速移动的染色体是作为亮点（ 图5A，区域2）中可见。 30分钟后，此区域的第一精母细胞已经处于末期（ 图5B中 ，箭头）。年轻的区域1的染色体排列在中期板20分钟后（ 图5C）。他们完成末期，并准备约15分钟后（ 图5D）经过细胞分裂。后期，末期和胞质分裂一直持续在该记录（ 补充视频2） 约 10分钟。 在哺乳动物中，以及在果蝇中组蛋白H4乙酰化的显着增长在减数分裂后，标志着去除组蛋白和HP交换机发作精子6,11。已经提出，这种表观遗传修饰是必需成分，甚至触发惠普的发育程序的开关10,32。以前，我们处理果蝇蛹睾丸文化与抑制剂靶向帽子和的HDAC在减数分裂后阶段12来影响组蛋白H4的乙酰化水平。在这些药理试验中，我们发现，组蛋白乙酰化是对精子发生的从与组蛋白为基础的染色质与鱼精蛋白为基础的染色质级阶段的进展至关重要。 图6和图7示出了使用同时含有漆树酸靶向蛹睾丸教的药理试验的代表性结果。睾丸在24小时薏仁从表达H2AvD-RFP和ProtamineB-EGFP苍蝇株进行了解剖。 ProtamineB-EGFP蛋白中不存在这些早期蛹睾丸（ 图6A和B）。经过24小时R中培养，所述控制睾丸表明ProtamineB-eGFP的信号，这表明在第一包囊已经发展超越惠普开关（ 图6A'，开放箭头）。这是不与150μM漆树酸（ 图6B'）处理睾丸的情况。睾丸壁球制剂和免疫荧光分析，提供更详细的信息（ 图7）。在未处理的对照，在比较大的初级精母细胞的细胞核可以通过其特征的丰富染色的DNA的三个区域，它们分别对应于主要的染色体果蝇 （ 图7A中 ，第1列）的（4C级）模式进行识别。组蛋白H4的乙酰化是清楚地检测到在这一阶段（ 图7B中 ，第1列）。减数分裂后的第一级被称为Nebenkern阶段，其特征是相当大的，圆形核（参见图4C，在图7中未示出）。在图7所示的下一阶段是由鞭毛生长和生殖细胞的细胞核，这已经比在较早的阶段（ 图7A，第2列）小得多，显示出非常低的组蛋白H4的乙酰化几乎检测不到的水平的圆形状识别（ 图7B，第2栏）。圆形状，然后拉长（ 图7A，第3栏），以及组蛋白H4的乙酰化是再次清楚地检测到（ 图7B，第3栏）。在精子细胞，然后到达独木舟造型阶段，其中高压开关发生和组蛋白被鱼精蛋白取代（ 图7A – 7℃，列4和5）。以下的独木舟阶段，protaminated晶核然后进一步拉长成非常细的针的形状，在成熟精子（此处未示出）。 用漆树酸处理过的睾丸睾丸壁球准备表现出不同的结果（ 图7D </ STRONG> – 7 F）。在用漆树酸处理过的细菌细胞中的染色质比未经处理的对照（比较图7D，处理和图7A，控制）的出现更稠。免疫荧光分析表明，H4的乙酰化被大大削弱，甚至在漆树酸（ 图7E）治疗生殖细胞的细胞核缺席。已知的是高度乙酰化的组蛋白与开放的染色质区域相关联，而缺乏组蛋白乙酰化的染色质区域经常显示出压迫性结构33。因此，它是不令人惊讶的是与漆树酸处理的影响的处理的生殖细胞的细胞核的染色质结构。重要的是，独木舟后期阶段或以后没有鱼精蛋白阳性细胞核被确定在治疗睾丸（ 图7F）。因此，我们的数据是一致的想法是一致的HAT活性是必不可少的精子进行来回米蛋白为基础的染色鱼精蛋白为基础的染色质的阶段。 果蝇精子发生的图1概述。左侧面板显示阶段的生精细胞发育的干细胞，以个性化的精子序列。示意图显示了生殖细胞的特征核形态。一个精原细胞分裂，产生16互联的精母细胞在一个囊肿。在此阶段所需的大部分减数分裂后发展的转录物的产生，翻译抑制，并进行存储。与进入减数分裂的转录活性的堆积结束。组蛋白对鱼精蛋白在染色质开关需要早期和晚期独木舟阶段之间发生。阶段与组蛋白为主的染色质高亮红色;用鱼精蛋白为基础的染色阶段以绿色突出显示。在右侧面板中的横道生殖细胞，可以在正常的开发睾丸中找到幼虫，蛹在约 24级和36小时puparium形成后（APF），和成蝇。 图2 果蝇精巢处于不同的发展阶段。 （一）第三龄幼虫（L3）的稍压扁全安装睾丸相衬图像。只有前减数分裂和减数分裂阶段都可以找到。精原细胞被限制在毂区域（星号）的下方前部尖端。剩余的睾丸充满精（空心箭头）（B）稍微压扁睾丸在约的相衬图像 puparium形成（APF）后24小时。除了 ​​精母细胞（空心箭头），睾丸中含有的Nebenkern级精子（开放箭头），圆核和精子细胞的延长阶段，不断增长的鞭毛（双开箭头）（C – E）整个安装蛹睾丸表达H2AvD-RFP和ProtamineB-EGFP（的相衬和EGFP和RFP的荧光图像叠加）（C）蛹睾丸解剖在约 24小时的APF。箭头标志着自体荧光推测脂肪体细胞。 四）蛹睾丸解剖在约 36小时薏仁显示第ProtamineB-EGFP阳性囊肿（箭头）（E）蛹睾丸在约 48小时的APF与一组ProtamineB-EGFP-阳性囊肿（箭头）。在所有图中零件，星号表示在轮毂的区域。比例尺：100微米。ANK“>请点击这里查看该图的放大版本。 图3 Live中的组蛋白对鱼精蛋白开关成像在蛹睾丸越来越体外 。 （一）蛹期睾丸表达H2AvD-RFP和ProtamineB-EGFP在约 45小时puparium形成（APF）后，考虑到文化的相衬图像。精囊是由实心箭头表示。 àparagonium（双箭头）仍附着于睾丸（A'）中的（A）所示的睾丸EGFP和RFP的荧光。开箭头表示ProtamineB-EGFP阳性囊肿。比例尺：100微米（B）2小时30分钟，在文化，一些进一步的囊肿（空心箭头）后出现FR嗡组蛋白对鱼精蛋白过渡（C）之后的附加 ​​长约3小时，在文化， 即共培养5小时29分，一组囊肿（空心箭头）具有较强的ProtamineB-EGFP信号是睾丸的近端可见。另见补充视频1。在所有图件，星号表示该枢纽地区。 请点击这里查看该图的放大版本。 图生殖细胞的4隔离囊肿处于不同的发展阶段。 （一）囊肿从睾丸解剖在puparium形成（APF）后约 24小时。叠加的相衬和H2AvD-RFP的荧光（红色）的图像。比例尺：100μm左右。（B – C）单一囊肿不同阶段的放大倍率。叠加的微分干涉对比（DIC）和H2AvD-RFP的荧光图像。比例尺：20微米（二）16精母细胞囊肿64圆形精子细胞（C）的囊肿在Nebenkern阶段。该Nebenkern结构从稠线粒体开发并在DIC图像上可见的旁核（开放箭头）。精子与轮H2AvD-RFP-阳性细胞核并拉伸鞭毛（D）的孢囊（开放箭头表示伸长Nebenkern结构，伴随着不断增长的轴丝）（E）精子的囊肿在早期阶段的独木舟出一个细长的核形的根尖顶端。在广泛细长的鞭毛只是部分可见。 请点击这里查看该F的放大版本。igure。 一个16精母细胞囊肿发生囊肿的文化减数分裂I 体外 。荧光图像表达H2AvD-RFP 的图5实时成像 。描绘的是减数分裂一，精母细胞中的囊肿通过在波浪状的方式减数分裂特性阶段：（A）染色体缩合开始在细胞核的囊肿（2）的一侧，并前进通过囊肿（方向由箭头指示）。细胞核中的相对的区域（1）代表的染色质缩合，其中组蛋白密集区域标记的三大染色体仍然可以辨别的早期阶段。在区域精母细胞（2）含有完全冷凝染色体，可见明亮的荧光斑点。（二）30后0;分钟，在区域中的第一精母细胞（2）是在末期（开放箭头），而染色体缩合继续在区域（1）（C）在区域中的最后一个精母细胞（1），染色体（箭头）排列。在中期板20分钟后，（D）在另15分钟，最后精母细胞似乎已完成末期和现在准备进行胞质分裂（开放箭头）。另见补充视频2比例尺：50微米，请点击这里查看该图的放大版本。 图6：漆树酸抑制组蛋白对鱼精蛋白在培养蛹睾丸开关。蛹睾丸expressi纳克H2AvD-RFP和ProtamineB-EGFP和puparium形成后解剖，在24小时（APF）孵育24小时，在培养基中不含抑制剂（对照A，A'，DMSO，二甲亚砜），或在培养基中添加150μM的漆树酸（ B，B'）。用星号标明毂区域（A，B）没有ProtamineB-EGFP-阳性囊肿可剥离后进行观察。（A'）后，培养24小时后，一些囊肿行的组蛋白对鱼精蛋白开关和ProtamineB-EGFP阳性用漆树酸处理过的孢囊（开放箭头）可以观察到（B'）的睾丸不发展ProtamineB-EGFP-阳性囊肿。比例尺：100微米请点击这里查看该图的放大版本。 68 / 51868fig7highres.jpg“WIDTH =”500“/> 图7漆树酸会影响组蛋白H4乙酰化和精子细胞的染色质结构 ，从蛹睾丸精子细胞的细胞核（24小时APF）的表达ProtamineB-EGFP培养24小时无抑制剂（A – C）的壁球准备。或150微米漆树酸（D – F）。 DNA用Hoechst染料（A和D）。 H4的乙酰化免疫荧光分析（B和E）。存在鱼精蛋白与ProtamineB-EGFP信号（C和F）监测的。以漆树酸处理后，将染色质出现强烈压实（D）和H4的乙酰化信号中所有精子细胞阶段（E）完全还原。此外，漆树酸处理过的睾丸显示独木舟后期阶段，或超出无囊肿，没有ProtamineB-EGFP信号（F）。比例尺：10微米，请点击这里查看该图的放大版本。 补充视频1，通过绿色荧光蛋白和组蛋白对鱼精蛋白开关的RFP荧光在线成像在蛹睾丸生长 6小时的时间过程的成像体外 。视频示出了通过增加ProtamineB-的患病组蛋白对鱼精蛋白过渡绿色荧光蛋白阳性囊肿。图像获取的，每5分钟。有关详细信息，请参阅图3。（请参阅“suppl_video_1.MOV”下载下）。 一个16精囊肿发生减数分裂补充视频2在线影像í 体外 。一时间推移荧光成像囊肿文化表达H2AvD-RFP超过80分钟的过程。这部影片描述了一减数分裂图像的特征阶段被收购每隔1分钟。有关详细信息，请参阅图5。（请参阅“suppl_video_2.MOV”下载下）。