マウス脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性：非放射性テロメラーゼリピート増幅プロトコル（TRAP）アッセイ

テロメラーゼは、テロメラーゼからなるリボ核タンパク質逆転写酵素（TERT）、テロメラーゼの触媒サブユニット、およびRNA成分（TERC）である。テロメラーゼの標準的な役割は、ゲノムの完全性を促進するため、テロメア末端に反復配列（TTAGGG）を添加することによりテロメアの適切な長さを維持することであり、細胞増殖^1。それはさまざまな損傷剤²により誘導されるアポトーシスに対する耐性を付与する、つまり追加の役割は、細胞内でTERTに起因した、酸化的ストレス³からのヒト間葉系幹細胞を保護し、肯定的なRNAをTIA1するその協会が完全に分化したニューロンにおける生存促進の役割を果たしている顆粒^4。

酵素発現および活性レベルは緊密に非分裂細胞^5,6で規制されている間TERTは、分裂細胞および癌のほとんどの種類の中で、主に体細胞で発現され、アクティブにされている。研究は、rの中でそれを示しているTERT mRNAが成人期⁷に低いレベルに維持しながらodent脳は、テロメラーゼ活性は、生後10日目では検出不可能になる。他の研究では、成人のサブ脳室帯、嗅球、海馬内のテロメラーゼ活性を示し、そして大人の小脳および皮質^8。 、注射したマウスSOD1トランスジェニックにおける筋萎縮性側索硬化症の発症および進行を遅延 – 私たちは、最近、脳および脊髄におけるテロメラーゼ発現および活性を増加させる新規化合物は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）における神経保護効果を発揮することを実証マウスおよびこれらのマウス⁹の脊髄における運動ニューロンの生存を増加させた。完全ニューロンおよび脳におけるテロメラーゼの生存促進の役割を理解するためには、脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性の検出のための単純かつ比較的敏感な高速アッセイを開発することが不可欠である。

テロメアREPEAT増幅プロトコール（TRAP）は、テロメラーゼの標準的な活性とポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を組み合わせるよく知られた高感度のアッセイである。このアッセイでは、テロメラーゼはTTAGGGがテロメラーゼ基質へのTSリバースプライマー用いて6塩基対（bp）のDNAラダー生成するPCR増幅に続いて（TSプライマー）、オリゴヌクレオチド、繰り返さ付加する。 – ACXを³² P標識dCTPを者が検出するために使用されるPCR産物の量が少ない。 DNAラダーは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を配列決定することにより解決される。どちらのDNAバンドの強度とDNAラダーの長さは、活性酵素分子の量とその処理能力はそれぞれ^10を反 ​​映している。

この伝統的なアッセイは、いくつかの主要な難しさを保持します（一晩どちらの場合も）シーケンシングPAGEおよびゲル走行時の消費量と放射性製品のフィルム露光を処理するために大規模なハード放射性物質への暴露の危険性。 </p>

このプロトコルは、改良された非放射性アガロースミニゲルに基づくアッセイを提供しています。 DNA 6 bpラダーは4.5％高分解能アガロースゲルを用いて解決され、検出は高感度の核酸染色を用いて達成される。高分解能アガロースミニゲルを用いて、敏感な核酸染色アッセイを扱うことは容易提供の組み合わせは、放射能への暴露の危険性を排除し、大幅に数時間から3日全体のアッセイ時間を短縮する。