Retningslinjer er presentert for generering av spekk kunstig antigen-presenterende celler, KaAPC, et effektivt verktøy for in vitro uttømming av humane antigen-spesifikke T-celler, og en alternativ løsning for å cellulær immunterapi for behandling av T-celle-medierte autoimmune sykdommer i et antigen bestemt måte uten at det går utover den gjenværende immunsystemet.
Nåværende behandling av T-celle-medierte autoimmune sykdommer avhenger for det meste på strategier for global immunsuppresjon, som i det lange løp, er ledsaget av uønskede bivirkninger, for eksempel en redusert evne til å kontrollere infeksjoner eller kreftformer. Derfor er nye fremgangsmåter må utvikles som er rettet mot bare den sykdomsmedierende celler og la det resterende immunsystemet intakt. I løpet av det siste tiår en rekke cellebaserte immunterapi strategier for å modulere T-celle medierte immunresponser er blitt utviklet. De fleste av disse metodene er avhengige av toleranseinduserende antigen-presenterende celler (APC). Imidlertid, i tillegg til å være teknisk vanskelig og tungvint, slike cellebaserte tilnærminger er svært følsomme for cytotoksiske T-celle-responser, som begrenser deres terapeutiske kapasitet. Her presenterer vi en protokoll for generering av ikke-cellulær morderen kunstige antigenpresenterende celler (KaAPC), som gjør det mulig for uttømming av patologiske T-celler og samtidig la reværende immunsystem urørt og funksjonell. KaAPC er en alternativ løsning til cellulær immunterapi som har potensiale for behandling av autoimmune sykdommer og allograft-avvisning ved å regulere uønskede T-celle responser på en antigenspesifikk måte.
I løpet av de siste to tiårene mye fremgang har blitt gjort i å forstå de sykdomsfremkallende mekanismene for autoimmune sykdommer. Men de mest vanlige behandlinger fremdeles er avhengige av kortikosteroider, samt immunosuppressive midler som purin-analoger, alkylerende midler og kalcineurinhemmere en. Bruken av slike stoffer har i høy grad forbedret prognosen for pasienter, men behandlingen gir ikke en helbredelse av den underliggende immunologiske funksjonsfeil. Videre pasienter blir utsatt for infeksjoner, og til utvikling av kreft.
Derfor er det endelige mål for behandling av T-celle-medierte autoimmune sykdommer og allograft-avvisning er spesifikt mot bare sykdomsfremkallende T-celler, mens, på samme tid, slik at den resterende immunsystem urørt og i stand til å bekjempe lidelser i immunsystemet. Utnytte antigen-presenterende celler (APC) som en behandling for å undertrykke perifere T-celle-responser ble først beskrevet så tidlig som i1970 av flere grupper. Siden da mange cellebaserte tilnærminger har blitt utviklet (anmeldt i Schütz et al. 2). Strategier bruker Fasl-uttrykke killer-APC som immunoregulatory celler viste lovende resultater indikerer terapeutisk potensial for behandling av autoimmunitet, allograft avvisning og kroniske infeksjoner. Men det er betydelige begrensninger med strategier utnytte Fasl Killer-APC som har til slutt begrenset deres kliniske anvendbarhet; (I) generering eller isolering av APC-er tid, arbeids-og kostnadskrevende (ii) pasienter som lider av cytopeni på grunn av immunsuppresjon gi begrensede mengder og kvalitet av celler (iii) belegg eller transduksjon av APC til apoptose som induserer signaler slik som Fasl resulterer i sterkt variable fenotyper og (iv) Killer-APC er følsomme overfor cytotoksiske effektor funksjoner av T-celler som dermed reduserer deres terapeutiske potensial. Derfor er det vanskelig å garantere en definert reproduserbar Killer-APC phenotype som kan utnyttes for antigen-spesifikke modulering av T-celle responser in vivo.
Basert på vår tidligere arbeid med Fasl uttrykker Killer-APC 3-5 og kunstige antigenpresenterende celler (AAPC) 6,7 vi utviklet en kulebasert tilnærming (KaAPC) for antigen-spesifikk inhibering eller eliminering av auto-reaktive T-celler i vitro. KaAPC består av HLA-A2-Ig-dimer (signal 1) og et anti-Fas mAb (apoptose induserende signal) kovalent immobilisert på en overflate av et 4,5 mikrometer paramagnetiske lateksperle. De utarme antigen-spesifikke T-celler i en Fas / Fasl mediert mote fra T-celle-kulturer av multiple spesifisiteter i en antigen-spesifikk måte og uavhengig av aktivering indusert celledød (AICD) pathway. Doseavhengig apoptose i målrettede T-celler er indusert raskt allerede etter 30 min 8.
KaAPC kan enkelt genereres på en kontrollert måte som sikrer en definert hyllevare phenotype og overvinne de fleste av svakhetene i cellebasert uttømming strategier. Følgelig KaAPC viser et stort potensiale for behandling av T-celle-medierte autoimmune sykdommer og allograft-avvisning, fremme innen T-celle-spesifikke behandlingsstrategier.
Den mest kritiske trinn i protokollen, er å sikre riktig forhold mellom signal 1 (peptid-MHC) og signal 2 (anti-Fas mAb). Vi har utført intensive titrering eksperimenter for å definere et perfekt forholdet for signalet 1 og 2; det ble klart at minimale variasjoner på grunn av forskjeller i HLA-A2 Ig dimer eller anti-Fas Mab konsentrasjoner kan forstyrre funksjonaliteten til KaAPC. Således bør konsentrasjonen av begge signaler alltid verifiseres og kvaliteten på begge proteiner bør ofte testet selv om det ble beordret fra en kommersiell kilde. Videre bør konsentrasjonene alltid bli bestemt av den samme assay som forskjellige deteksjonsanalyser kan resultere i forskjellige konsentrasjoner. Funksjonalitet av HLA-A2-Ig kan også bli svekket på grunn av ufullstendig refolding og / eller ineffektiv peptid lasting. Videre dimer-molekyler kan aggregere til forskjellige grader, noe som kunne påvirke den funksjonelle aktiviteten av proteinet. Derfor actual mengde av dimer som er nødvendig for generering av et funksjonelt og spesifikk KaAPC kan variere. I tillegg fant vi at den ideelle området for drapet induserende signal anti-Fas mAb på KaAPC er svært stramt. I våre hender større mengder 3,64 ug / ml føre til ikke-spesifikk dreping av Fas-positive T-celler, mens mengder under 3,64 ug / ml resulterte i en dose-avhengig dreping redusert aktivitet. Selv om disse betingelser synes ganske stramt, vil hensyn til disse detaljer resultere i generering av en funksjonell og spesifikk KaAPC.
Mens den aktuelle KaAPC fenotype er funksjonell for uttømming av aktivt antigen-spesifikke T-celler, innledende forsøk rettet mot naive eller hvilende antigen-spesifikke T-celler viste ingen signifikant induksjon av antigen-spesifikk apoptose som disse populasjonene har redusert Fas ekspresjon. Derfor kan man tenke seg å legge et ko-stimulerende signal på KaAPC å indusere den opp-regulering av Fas på hvilende T-celler til å slå deminn et mål for KaAPC. Selv om dette er mulig alle tre signaler må nøye kontrolleres for å sikre en funksjonell KaAPC fenotype.
Justere perle plattform til en biokompatible eller biologisk nedbrytbar matrise vil styrke KaAPC in vivo anvendbarhet. Nylig, har rapportert Shen et al. Den vellykkede in vivo-bruk av KaAPC benytte 5 mikrometer latekskuler konjugert til anti-Fas (klon Jo2) og anti-His / H2-K b -TRP2 11. Vi har vært i stand til å vise at det generelle begrepet kunstige antigenpresenterende celler (AAPC) kan med hell overføres fra mikrometer dimensjonert til nm størrelse partikler 12 og at funksjonaliteten er påvirket av partikkel geometri 13. Således, ved å variere størrelsen og / eller formen på fremtidig KaAPC design man kan være i stand til å påvirke den in vivo funksjonalitet og bio-fordeling, noe som kan være avgjørende for vellykket behandling av organspesifikke autoimmune sykdommer.
<p class = "jove_content"> KaAPC vinne de store svakhetene i cellebasert uttømming strategier som en enkel å bruke "hyllevare", tid og kostnadseffektiv tilnærming som er uavhengig av donor tilstand og forbehandling. KaAPC er ikke et mål for selv eller parakrint drap signale og ikke følsomme for cytolytiske effektorfunksjoner av CTL. KaAPC krever identifikasjon av den aktuelle sykdom antigen og stole på sin spesifikke HLA-type. Mens for tiden tallrike egnede HLA-A2 bundne antigener for type 1-diabetes, har GvHD og multipler sklerose blitt identifisert 2, utvikling av ytterligere HLA klasse I dimer-molekyler, så vel som den pågående identifisering av nye autoimmune relevante antigener vil ytterligere øke og utvide anvendbarheten KaAPC. Videre kunne man tenke på å bruke KaAPC rettet mot ulike epitoper å målrette flere antigener samtidig.I sammendraget, KaAPC representerer en fleksibel plattform-teknologi for enTigen spesifikke T-celle uttømming. Deres "lego-lignende" natur gjør at inkludering av nye signaler eksempel ekstra co-stimulerende eller hemmende signaler som PD1 eller sti på ulike matriser, som kan utvide og forbedre deres påfølgende in vitro og in vivo anvendbarhet. Vi her presentere steg-for-steg-protokollen for å generere KaAPC, den første perlen basert tilnærming for eliminering av antigen-spesifikke T-celler fra T-celle blandinger med ulike særegenheter.
Figur 3. KaAPC eliminere CTL i et antigen-spesifikt mote PKH26-merkede aktiverte Fas + effektor-minne CTL og PKH67-merket CMVpp65-spesifikke CTL fra den samme donor, ble blandet til en 1:. 1 forhold og ko-dyrket med CMVpp65 KaAPC i 48 timer. Kontrollkulturene ble behandlet med losset KaAPC, eller 1 pg / mlav løselige anti-Fas-MAB (klone CH11). Minimalt tap av levedyktige celler ble bestemt i ubehandlede blandede kulturer (CTL T blanding). Originale FACS data for hver CTL befolkningen i T-mix blir vist. Analyse av apoptose ble utført som tidligere publisert av separate gating på begge T-cellepopulasjoner 10. Numrene beskrevet i de øvre venstre kvadrantene representerer% av totalt antall celler. Den illustrerer figuren er avledet fra en representativt eksperiment av tre uavhengige eksperimenter. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Blood. . Schütz, C. et al Killer kunstige antigenpresenterende celler: en roman strategi for å slette spesifikke T-celler Blood.. 2008; 111, 3546-52. Copyright American Society of Hematology. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet har vært støttet av den tyske Research Foundation (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) og KFO 146 (MF), DOD Department of Defence stipend PC 040972 (MO) og National Institute of Health gir RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)
Name | Company | Cat # | Comments |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
human AB serum | Atlanta biologicals | S40110 | |
EDTA | Sigma/Aldrich | E5134 | |
sodium azide | Sigma/Aldrich | 71289 | |
M-450 epoxybeads | Invitrogen/Dynal | 14011 | |
MPC-1 magnet | Invitrogen/Dynal | 12001D | |
screw top glass vial | Fisher Scientific | 03-338AA | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
anti-CD95 (clone CH11) | Milliore | 05-201 | |
HLA-A2-Ig dimer | BD/Pharmingen | 551263 | |
Cryo-tube 2ml | Corning | 430488 | |
anti-mouse IgG1 PE | BD/Pharmingen | 559320 | |
anti-mouse IgM FITC | BD/Pharmingen | 553408 | |
sodium chloride | Merck | S271-3 | |
calcium chloride | Sigma/Aldrich | C5080 | |
HEPES | cellgro/Mediatech | 25-060-CI | |
RPMI | gibco/life technologies | 11875-085 | |
96well round bottom plate | Falcon | 353077 | |
AnnexinV FITC | PromoKine | PK-CA577-1001-1000 | |
7-AAD | BD/Pharmingen | 51-68981E | |
FACS tubes | Falcon | 352008 |