I denne undersøgelse en ny platform undersøge intraneuronale molekylære underskrifter af behandlingsrespons ved bipolar sygdom (BD) blev udviklet og valideret. Lugteepitel fra BD patienter blev opnået gennem nasale biopsier. Så laser-capture mikrodissektion blev kombineret med Real Time RT-PCR til at undersøge den molekylære signatur af lithium respons i BD.
Bipolar lidelse (BD) er en alvorlig neuropsykiatrisk lidelse med dårligt forstået patofysiologi og typisk behandlet med stemningen stabilisator, lithiumcarbonat. Dyreforsøg samt humane genetiske undersøgelser viser, at lithium påvirker molekylære mål, der er involveret i neuronal vækst, overlevelse og modning, og især molekyler involveret i Wnt signalering. I betragtning af den etiske udfordring at opnå hjernen biopsier for at undersøge dynamiske molekylære ændringer er forbundet med lithium-respons i det centrale nervesystem (CNS), kan man overveje at anvende neuroner opnået fra olfaktoriske væv for at nå dette goal.The lugteepitel indeholder olfaktoriske receptor neuroner på forskellige stadier af udvikling og glia-lignende støtte celler. Dette giver en unik mulighed for at studere dynamiske ændringer i CNS af patienter med neuropsykiatriske sygdomme, ved hjælp af olfaktoriske væv sikkert fås fra nasale biopsier. For at overvinde den ulempe udgøres af substantial forurening af biopsi olfaktoriske væv med ikke-neuronale celler, blev en ny tilgang for at opnå berigede neuronal cellepopulationer udviklet ved at kombinere nasale biopsier med laser-capture mikrodissektion. I denne undersøgelse blev et system til undersøgelse behandlingsrelaterede associeret dynamiske molekylære forandringer i neuronvæv udviklet og valideret ved hjælp af en lille pilot prøve af BD patienter rekrutteret til studiet af de molekylære mekanismer i lithium behandlingsrespons.
Bipolar lidelse (BD) er en alvorlig neuropsykiatrisk lidelse, karakteriseret ved patologiske ændringer i humør, drive og kognition 1. Lithium anvendes til behandling af BD har vist sig at ændre steady state mRNA niveauer af et stort antal gener i dyreforsøg 2, men det er uvist, om nogen af disse molekyler er forbundet med klinisk respons hos mennesker 2. Forståelse mekanismen af lithium reaktion ville kræve undersøgelse lithium-induceret molekylære ændringer i neuronale væv. Desværre er det ikke praktisk at få hjernen biopsier af BD patienter før og efter lithium terapi for at identificere molekylære signaturer af lithium respons. Post-mortem hjernevæv er blevet anvendt til at undersøge biomarkører i BD, men de kan ikke anvendes til at vurdere molekylære markører forbundet med dynamiske ændringer i følelser, kognition og drev; og gyldigheden af efterfølgende konstateret lithium behandlingsrespons kan være problematisk 4. Lymfocytter og andre blodceller kan være nyttige, men molekylære ændringer i blodcellerne kan afvige neuronal ændringer 3-5. Cerebrospinalvæske kan være utilstrækkelig til at indhente oplysninger om intracellulære molekyler, som kan afspejle sygdomsassocierede og medicin-reversibel iboende forandringer.
Lugteepitelet (OE) er en unik del af det centrale nervesystem (CNS), embryologisk relateret til limbiske strukturer 6; og det er let tilgængeligt via nasal biopsier. Den består af glial-lignende støtte (dvs. sustentacular) celler basal prolifererende celler og olfaktoriske receptor neuroner på forskellige stadier af udvikling 7-9. Derfor OE giver en enestående mulighed for at accessibly studere dynamiske ændringer i CNS af patienter med neuropsykiatriske sygdomme 7. Undersøgelser demonstrerer anvendeligheden af OE som surrogat væv til undersøgelse af sygdoms- forbundet begivenheder, der afspejler disse OCCurring i hjerneneuroner 8,9. For eksempel har undersøgelser udnyttes OE for at undersøge molekylære profiler forbundet med psykiatriske lidelser 10-14. Lugtesystemet også tjener til at identificere kliniske endophenoytpes såsom lugt underskud, der er forbundet med de negative symptomer på skizofreni 15. Derudover fortsætter neurologiske processer i OE gennem hele livet, der giver et nyttigt avenue at modellere den underliggende patofysiologi psykiatriske tilstande 8,9.
Men en ulempe ved anvendelsen af dette væv er den betydelige forurening af olfaktoriske biopsier med ikke-neuronale celler 16. For eksempel total RNA anvendes til genekspressionsstudier i tidligere OE undersøgelser indeholdt RNA ekstraheret fra hele nasal biopsi væv, herunder RNA fra ikke-neuronale celler 17. Derfor har de tidligere metoder været begrænset af kvaliteten af celler. For at overvinde dette problem, at en ny tilgang opnå berigede neuronale cellepopulationer ved at kombinere nasale biopsier med laser-capture mikrodissektion (LCM) er blevet udviklet 18.
LCM er en teknik, der giver mulighed for selektiv isolering af celler under anvendelse af UV laserskæring kombineret med infrarød laser 19-21. Kombinere LCM med OE tilgang minimerer væsentlig forurening af OE af ikke-neuronale celler og dermed øge berigelse af neuronale celler 18. Desuden kan den neuronale lag adskilles fra submucosa lag under et mikroskop, hvilket eliminerer behovet for farvning. Neuronale celletyper kan yderligere skelnes fra andre cellepopulationer med primære antistoffer, som udtrykkes af celletypen af interesse 7. Derfor er denne procedure etablerer en lettere fremgangsmåde til berigelse af næsten rent neuronal cellepopulation, der kan anvendes til genekspression undersøgelser, immunhistokemi og andre morfologiske undersøgelser.
ve_content "> Denne undersøgelse har til formål at etablere en eksperimentel platform for at undersøge molekylære forandringer i olfaktoriske neuroner forbundet med sygdomstilstande og behandlingsrespons. For at løse dette, et lille sæt af røgfrie patienter, som opfyldte DSM-IV diagnostiske kriterier for BD baseret på Diagnostic interview til genetiske undersøgelser (DIG) 22 blev ansat til at gennemgå to nasale biopsier: en biopsi før behandling med lithium og den anden biopsi, efter 6 ugers daglig oral lithium terapi Endvidere skal de støtteberettigede BD patienterne være:. symptomatisk for depression baseret på at lave ≥10 ud af 60 i klinikeren administreret Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23 symptomatisk for hypomani eller mani, baseret på en score ≥10 ud af 56 på klinikeren administreret Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24. eller ≥10 på begge MADRS og YMRS Rater-Inter-Rater koefficient på aftale mellem klinikere for begge skalaer er> 0,96 Efter biopsier, neuroner var Enri.tede fra OE ved LCM. Efter yderligere kontrolforanstaltninger kvalitet, for at sikre, udvinding af høj kvalitet RNA fra væv og neuronal berigelse, blev Real Time RT-PCR udført for at undersøge før og efter behandling ekspressionsniveauer af gener af interesse. De efterfølgende afsnit indeholder en beskrivelse af valideringen af denne tilgang, fremhæver optimering af protokollen og de strategier, der blev ansøgt om fejlfinding protokollen.En ny platform for at opnå berigede olfaktoriske neuronale lag ved at kombinere nasal biopsi og LCM præsenteres og er blevet valideret i denne undersøgelse. Denne teknik kan have omfattende konsekvenser. Det kan anvendes mod biomarkør undersøgelser, også for behandlingsrespons og drug discovery indsats for andre neuropsykiatriske tilstande, hvilket gør en bredere indvirkning på området.
For at opnå høj kvalitet neuroner høj modtagelige for efterfølgende anvendelser, skal nogle f…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).
We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.
Reagent | Manufacturuer | Manufacturer Catalog # |
Tissue Preparation | ||
Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 |
Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 |
Cryosectioning | ||
Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 |
Rnase Zap | Ambion | AM9780 |
DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 |
Microdissection | ||
Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | |
Model: Axiovert 200M | ||
Software: Robo v3.2 | ||
No.5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 |
RNA Extraction | ||
RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 |
cDNA Synthesis | ||
SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 |
OMP qPCR | ||
SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 |
Taqman qPCR | ||
TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 |