I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali

Il disturbo bipolare (BD) è un grave disturbo neuropsichiatrico, caratterizzato da alterazioni patologiche di umore, guidare e cognizione ^1. Litio usato per il trattamento di BD ha dimostrato di alterare costanti i livelli di mRNA stato di un gran numero di geni in studi su animali ^2, ma rimane sconosciuta se uno qualsiasi di queste molecole è associato con risposta clinica nell'uomo ^2. Comprendere il meccanismo di risposta litio richiederebbe indagare i cambiamenti molecolari litio-indotta nei tessuti neuronali. Purtroppo, non è pratico di ottenere biopsie cerebrali di pazienti BD prenatale e della post-litio per identificare le firme molecolari di risposta litio. Post-mortem tessuti cerebrali sono stati utilizzati per studiare biomarcatori in BD, tuttavia, non possono essere utilizzati per valutare marcatori molecolari associati con i cambiamenti dinamici in emozioni, cognizione e guidare; e la validità di retrospettivamente accertato risposta al trattamento di litio può essere problematico ⁴. I linfociti e le altre cellule del sangue possono essere utili, ma i cambiamenti molecolari nelle cellule del sangue non possono riflettere le alterazioni neuronali ^3-5. Liquido cerebrospinale potrebbe essere insufficiente per ottenere informazioni su molecole intracellulari che possono riflettere associate alla malattia e farmaci reversibile modifiche intrinseche.

L'epitelio olfattivo (OE) è una parte unica del sistema nervoso centrale (SNC), embriologicamente legati alle strutture limbiche ^6; ed è facilmente accessibile attraverso biopsie nasali. Si compone di gliali come cellule di supporto celle (cioè, sustentacular), basali proliferanti, e neuroni olfattivi a diversi stadi di sviluppo ^7-9. Pertanto, OE offre un'opportunità unica per studiare accessibilmente cambiamenti dinamici nel sistema nervoso centrale dei pazienti con malattie neuropsichiatriche ^7. Gli studi stanno dimostrando l'utilità del OE come un tessuto surrogato per studiare la malattia associata eventi che riflettono tali occurring in neuroni cerebrali ^8,9. Ad esempio, gli studi hanno utilizzato OE per indagare i profili molecolari associati alle condizioni psichiatriche ^10-14. Sistema olfattivo serve anche ad identificare endophenoytpes clinici come deficit odore che sono associati con i sintomi negativi della schizofrenia ^15. Inoltre, i processi di sviluppo neurologico continuano nella OE per tutta la vita, fornendo un viale utile per modellare la fisiopatologia di condizioni psichiatriche ^8,9.

Tuttavia, un inconveniente per l'uso di questo tessuto è la sostanziale contaminazione biopsie olfattivi con cellule non-neuronali ^16. Per esempio, l'RNA totale utilizzato per studi di espressione genica in studi precedenti OE conteneva RNA estratto da nasale intera biopsia tissutale compreso RNA da cellule non-neuronali ^17. Pertanto, gli approcci precedenti sono stati limitati dalla qualità delle cellule. Per ovviare a questo problema, un nuovo approccio per ottenere arricchito popolazioni di cellule neuronali combinando biopsie nasali con laser-capture microdissezione (LCM) è stato sviluppato ^18.

LCM è una tecnica che consente l'isolamento selettivo di cellule usando taglio laser UV combinato con infrarossi laser ^19-21. Combinando LCM con approccio OE minimizza sostanziale contaminazione OE da cellule non-neuronali, migliorando così l'arricchimento delle cellule neuronali ^18. Inoltre, lo strato neuronale può essere distinto dallo strato sottomucosa al microscopio, eliminando così la necessità di colorazione. Tipi di cellule neuronali possono più essere distinti da altre popolazioni cellulari utilizzando anticorpi primari che sono espressi dal tipo di cellula di interesse ^7. Pertanto, questa procedura prevede un metodo più semplice per l'arricchimento di popolazione cellulare quasi puramente neuronale che può essere utilizzato per studi di espressione genica, immunoistochimica e altre indagini morfologiche.

ve_content "> Questo studio mira a istituire una piattaforma sperimentale per studiare i cambiamenti molecolari nei neuroni olfattivi associati stati di malattia e la risposta al trattamento. Per risolvere questo problema, un piccolo gruppo di pazienti non-fumatori che hanno incontrato i criteri diagnostici del DSM-IV per BD basa su Intervista diagnostica per studi genetici (DIG) ²² è stato reclutato per subire due biopsie nasali: una biopsia pre-trattamento con litio e la seconda biopsia, dopo 6 settimane di terapia quotidiana litio orale Inoltre, i pazienti BD ammissibili devono essere:. sintomatico per la depressione , basata sul punteggio ≥10 su 60 nella clinico somministrato Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) ^23; sintomatica per ipomania o mania, sulla base di un punteggio ≥10 su 56 sul medico somministrato Young-Mania Rating Scale (YMRS) ^24;. o ≥10 su entrambi MADRS e YMRS coefficiente Rater-Inter-Rater di un accordo tra i medici sia per le scale è> 0.96 Dopo biopsie, i neuroni erano Enri.ched da OE da LCM. A seguito di misure di controllo supplementari di qualità, al fine di garantire l'estrazione di RNA di alta qualità dal tessuto e arricchimento neuronale, Real Time RT PCR è stato condotto per indagare i livelli di pre e post-trattamento di espressione dei geni di interesse. Le sezioni successive contengono una descrizione della convalida di questo approccio, mettendo in evidenza l'ottimizzazione del protocollo e le strategie che sono state applicate per la risoluzione dei problemi del protocollo.