تحديد تفاعلات البروتين يجند عن طريق المسح الضوئي التفاضلية Fluorimetry
Summary
Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.
Abstract
هناك مجموعة واسعة من وسائل متاحة لتحديد التفكك المستمر بين البروتين والتفاعل الجزيئات الصغيرة حاليا. ومع ذلك، فإن معظم هذه تتطلب الوصول إلى معدات متخصصة، وغالبا ما تتطلب قدرا من الخبرة لإقامة فعالية تجارب موثوقة وتحليل البيانات. وتستخدم بشكل متزايد التفاضلي fluorimetry المسح (DSF) كوسيلة من وسائل قوية لفرز أولي من البروتينات للتفاعل جزيئات صغيرة، إما لتحديد الشركاء الفسيولوجية أو لاكتشاف ضرب. هذا الأسلوب له ميزة أنه يتطلب سوى آلة PCR مناسبة للالكمي PCR، ومناسبة حتى الأجهزة متاح في معظم المؤسسات. مجموعة ممتازة من البروتوكولات متاحة بالفعل؛ وهناك سوابق قوية في الأدب لاستخدامات متعددة من طريقة. وقد اقترح العمل السابق عدة وسائل لحساب ثوابت التفكك من البيانات مهرجان دبي للتسوق، ولكن هذه هي تطلبا رياضيا. هنا، نحن ماركاonstrate طريقة لتقدير ثوابت التفكك من كمية معتدلة من البيانات التجريبية مهرجان دبي للتسوق. يمكن عادة هذه البيانات يتم جمعها وتحليلها في غضون يوم واحد. علينا أن نظهر كيف نماذج مختلفة يمكن استخدامها لتتناسب مع البيانات التي تم جمعها من الأحداث ملزمة بسيطة، وحيث المواقع التعاونية ملزمة، أو مستقلة ملزمة موجودة. وأخيرا، نقدم مثالا لتحليل البيانات في حالة حيث لا تنطبق النماذج القياسية. يتم توضيح هذه الأساليب مع البيانات التي تم جمعها على البروتينات تحكم المتاحة تجاريا، واثنين من البروتينات من برنامج البحوث لدينا. وعموما، يوفر طريقة لدينا وسيلة مباشرة للباحثين للحصول على مزيد من التبصر بسرعة تفاعلات البروتين يجند باستخدام مهرجان دبي للتسوق.
Introduction
سيتم ربط جميع البروتينات، مع الانتماءات متفاوتة، لمجموعة متنوعة من الجزيئات الأخرى من أيونات بسيطة لالجزيئات الكبيرة الأخرى. في كثير من الحالات، والبروتينات ربط للشركاء جزيء صغير كجزء من وظيفتها الطبيعية (على سبيل المثال، كيناز ملزمة لATP). قد تكون التفاعلات الأخرى لا علاقة لها وظيفة، ولكنها مفيدة تجريبيا كأدوات (مثل الجزيئات الصغيرة التي استقرار البروتينات لتحسين نجاح تبلور، أو المساعدة في الحفاظ البروتينات في الحل). بينما الجزيئات الصغيرة التي تربط إلى مواقع نشطة والمواقع تفارغي من البروتينات يمكن أن تكون بمثابة مثبطات، وهكذا تعدل من نشاط الانزيمات.
هناك مجموعة واسعة من التقنيات التي يمكن استخدامها لتحديد تقارب من البروتينات لجزيئات الشريكة. وينظر متساوي الكالوري المعايرة 1 على نطاق واسع بأنه "معيار الذهب"، لأنه يقدم معلومات غنية على ردود الفعل، والتسمية خالية، وفرص محدودة لrtifacts التجربة. ومع ذلك، على الرغم من التحسينات الأخيرة في حساسية الأجهزة وأتمتة التجريبية مجموعة المتابعة، فإنه لا يزال مكلفا نسبيا من حيث الاحتياجات من البروتين، وعلى أحسن تقدير إنتاجية المنخفضة والمتوسطة، والأنسب لتفاعلات مع معتدلة إلى الانتماءات عالية (10 نانومتر إلى 100 ميكرومتر K د) 2. طرق تسمية أخرى مجانية مثل الرنين مأكل السطح أو طبقة ثنائية التداخل 3 عرض الانتاجية العالية، وحققت حساسية للكشف عن جزيئات أصغر منخفضة تصل إلى 100 دا. ومع ذلك، وأدوات الإنتاجية العالية لهذه الطرق مكلفة نسبيا، لها ما يبررها فقط حيث سيكون هناك الإنتاجية المستمرة للمشاريع ذات الصلة، وذلك يحتمل أن تكون بعيدة عن متناول العديد من المختبرات الأكاديمية.
وكان أول وصف الفرق fluorimetry المسح (مهرجان دبي للتسوق، أو thermofluor) في عام 2001 4 كطريقة لاكتشاف الأدوية. في هذا methoد، يتم تحضين البروتينات مع صبغة الفلورسنت (استخدمت الأصباغ في البداية، النفثالين السلفونيك)، الذي يغير مضان طلبها ملزمة للمناطق مسعور من البروتينات. العينة البروتين صبغة ثم هي ساخنة، ومضان مراقبة مع ارتفاع الحرارة. تتكشف من البروتين، والتعرض لأجزاء مسعور من البروتين، يؤدي إلى وجود نمط مميز في مضان بوصفها وظيفة من درجة الحرارة (الشكل 1A). التجربة يمكن أن يؤديها في كميات صغيرة في أي صك PCR الكمي التجاري، وذلك في تجربة واحدة، وعدد كبير من العينات يمكن اختبار في وقت واحد (عادة 48، 96 أو 384 عينات، اعتمادا على نموذج الصك). يمكن عادة أن يؤديها في التجارب حول وجود ساعة، وتوفير إمكانية تحليل إنتاجية عالية من العينات 5.
شهدت تحسينات أخرى لمنهجية اعتماد الأصباغ مع أفضل الخصائص الطيفية 6،7 </سوب>، أدوات عامة لتحليل البيانات، واقترحت بروتوكولات الفحص الأولي 8،9. وقد تم تمديد نطاق التطبيقات للأسلوب، مع التركيز بشكل خاص على إيجاد الظروف المثلى لإعداد وتخزين البروتينات 10، وعلى تحديد الشركاء المحتملين ملزم لمساعدة تبلور 11. على إنتاجية عالية نسبيا من طريقة، منخفضة التكلفة نسبيا بالبروتين (~ 2 ميكروغرام في رد الفعل) جعلت، وتطبيق لدراسة الجزيئات ملزمة ضعيفة DSF أداة قيمة لجزء يستند تصميم المخدرات، لا سيما في سياق أكاديمي 12-14.
على الرغم من تطبيق واسع من مهرجان دبي للتسوق لدراسة تفاعلات البروتين يجند، ووصف عدد قليل من الدراسات تحديد ثوابت التفكك من هذه الدراسات. ومع ذلك، فقد اتجهت هذه المعادلات لإنتاج مفصلة تصف تتكشف من البروتين، مع العديد من المعلمات التي يجب تركيبها على البيانات متفرق أو في بعض الحالات البريدstimated 7،15-17. هذه الأساليب هي ذات أهمية خاصة في الحالات الصعبة، مثل المركبات ملزمة بإحكام، أو البروتينات التي تظهر التحولات غير عادية. ومع ذلك، بالنسبة لكثير من المختبرات، وهذه التحليلات التفصيلية هي مرهقة جدا للاستخدام الروتيني. لذا نقترح العلاجات البديلة لسيناريوهات مختلفة، وإظهار كيف يمكن استخدام هذه البيانات لتناسب مختلف التفاعلات الناتجة عن البروتين يجند. يستخدم أسلوب لدينا الصك StepOne QPCR، التي برمجيات تحليل البيانات مفصل متاح. بينما هذا يسرع تحليل البيانات، ويمكن معالجة النتائج من الأدوات الأخرى باستخدام أساليب نشرت سابقا 9، ويمكن إجراء نفس التحليل المصب.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أثبت المسح التفاضلي fluorimetry قوتها كوسيلة قوية وتنوعا لوصف البروتينات، وتحديد البروتين بروابط المحتملة. جعلت من وسيلة جذابة لفرز أولي من المركبات النجاحات موثقة جيدا في التعجيل استقرار البروتين، واكتشاف الأدوية (خصوصا في المختبرات أقل ممولة جيدا) وتبلور 10،23-25. مركبات تضاف إلى البروتينات تظهر جرعة زيادة واضحة تعتمد في الظاهر درجة حرارة انصهار 7،9. ومع ذلك، كانت هناك بعض المحاولات لاستخدام نتائج هذه التجارب لتحديد ثوابت ملزمة واضحة للمساعدة في ترتيب المركبات للتقارب بهم. هنا، نقدم طريقة لتحديد منهجية ثابتة والتفكك الظاهر للبروتينات في وجود يجند.
توضح النتائج المعروضة هنا أن مهرجان دبي للتسوق يمكن أن بسرعة وبقوة تقديم تقديرات ثابت التفكك لمزيج من البروتين يجند. يمكن التلاعب البيانات لاحظ مع الأدوات المتاحة تجاريا لتقديم تقرير سريع للK د، دون الحاجة إلى وضع افتراضات بشأن القيمة المحتملة من المعلمات. طريقة ديه ميزة كبيرة على بعض أساليب مماثلة من كونه شديد البخل في كل من البروتين والوقت المطلوب. فإن التجربة الموصوفة هنا تستهلك 0.13 ملغ من البروتين لكل تجربة (تقريبا 0.4 ملغم للتجارب المتكررة في ثلاث نسخ). هذا يقارن ايجابيا مع الكالوري المعايرة متساوي الحرارة (ITC)، حيث تجربة واحدة بمتوسط 40 كيلو دالتون البروتين سوف تستهلك كمية مماثلة. ان مجموعة كاملة من التجارب المطلوبة لهذا البروتوكول تستهلك حوالي 4 ساعة، بما في ذلك إعداد، لمجموعة واحدة من التجارب. مرة أخرى، هذا من المرجح أن يكون أسرع بكثير من الطرق مثل ITC أو مأكل سطح الرنين، والتي غالبا ما تتطلب قوة في حين الأمثل كبيرا لتحقيق أفضل البيانات.
وتظهر نتائجنا أنه ما زال هناك شرط أن تدرس بعناية البيانات الخام، وتناسب هذه البيانات لتحديد درجة حرارة انصهار، ونوبة من البيانات لتحديد درجة حرارة انصهار ثابت التفكك. والتحدي الأول هو شكل من البيانات الخام المنتجة في ذوبان البروتين. في بعض الحالات، قد لا الشكل التقريبي لتلك التي لوحظت في الشكل 1A. وتشمل القضايا المشتركة نوبات انخفاض درجة الحرارة على يجند ملزمة، وارتفاع مضان الخلفية، والتحولات متعددة غير عادية في درجات الحرارة. وينظر إلى التحولات على درجة حرارة منخفضة ملزمة عددا من يغاندس. لهذا الأسلوب، المعلمة الأكثر أهمية هو الخطأ في قياس T م، مقارنة مع التحول في درجة الحرارة. يمكن عادة البيانات تركيبها بشكل معقول عندما يكون الانحراف المعياري للقياسات ثلاث نسخ لا تتجاوز 10٪ من التحول درجة حرارة انصهار بين البروتين غير منضم والمربوطة بالكامل. تجربتنا هو أن مثل هذه حيث درجة الحرارةالتحولات erature هي فقط 2 درجة مئوية، وهذا يمكن أن يكون كافيا لتركيب البيانات، إذا كانت نقاط البيانات الفردية هي دقيقة للغاية. يتشكل المسألة الثانية غير عادي المنحنيات. هذه غالبا ما تختلف بين الحرة وأشكال البروتين يجند ملزمة، كما يجند ملزم يؤثر تتكشف وسائط من البروتين. في هذه الحالات، يجب على المستخدم أن تنظر في ما إذا كانت البيانات يمكن استخدامها مع الاعتبار المناسب من النماذج التي ستستخدم لتحديد درجة حرارة انصهار وثابت التفكك. قضية مشتركة أخرى هي أن إضافة العامل المساعد للبروتين (على سبيل المثال، MgCl 2 في مثالنا مع هيكسوكيناز) مطلوب للحصول على البيانات الأكثر موثوقية. كانت تجربتنا أن دراسة متأنية لجميع العوامل المحتملة في التجربة في مرحلة أخذ القراءات الأولية لا بد من الحصول على أفضل النتائج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن العلاجات البديلة النظرية تكشف عن ملامح هذه البيانات 15،17. وأخيرا، فإنه ليس من غير المألوف بالنسبة لبعض البروتينات التي جontain أصلا تتعرض المناطق مسعور لإظهار عالية مضان الخلفية. هناك عدد من الحلول لهذه المشاكل، والتي تم استعراضها على نطاق واسع في أماكن أخرى 6،9.
على وجه الخصوص، يجب على المستخدم أن تنظر في ما إذا كان استخدام بولتزمان أو النماذج المشتقة (مثل الشكل 4)، وفي حالة استخدام المشتقات، سواء يذوب متعددة يجب أن تكون على غرار. طريقتين للنمذجة الحرارية التي تتكشف تختلف في أن طريقة بولتزمان يناسب البيانات التجريبية للمعادلة بولتزمان، على افتراض شكل السيني منتظم لمنحنى تتكشف. في المقابل، فإن طريقة المشتقة يأخذ أول مشتق من البيانات التجريبية عند كل نقطة (اللوحة السفلى في الشكل 1A)، وتعتبر درجة حرارة انصهار لتكون وجهة الأعلى أولا مشتق. طريقة المشتقة يعود عموما درجة حرارة انصهار أعلى بنحو 2 – 3 درجات مئوية. فإن معظم البروتينات بإرجاع أكثر اتساقانتيجة (أي الخطأ المعياري لدرجة حرارة انصهار للتجارب ثلاث نسخ أقل) في واحدة من طريقتين. هذا هو عادة ترتبط ارتباطا وثيقا الشكل الدقيق للبروتين تتكشف منحنى، وأنه من الضروري لتحديد أفضل طريقة تجريبيا في كل حالة. حيث يتم استخدام نموذج مشتق، من المهم أيضا النظر إلى الأحداث ذوبان متعددة. تظهر بعض البيانات بوضوح الأدلة على التحولات متعددة، وفي هذه الحالات نتائج من المحتمل أن يكون من الأسهل لتفسير إذا غرار هذه الأحداث ذوبان متعددة. في سياق هذا البروتوكول، هو حالة أن إضافة يجند يمكن أن يسبب البروتين ليتحول من وجود التحولات ذوبان متعددة لانتقال واحد (على سبيل المثال، عن طريق تثبيت فرعي الأكثر هشاشة حراريا)، أو العكس في كثير من الأحيان. ولذلك فإننا ندعو إلى أن البيانات الأولية يتم فحص معا قبل النظر في النهج الذي سوف يكون من الأفضل للاستخدام.
بعد مodelling من درجات الحرارة وذوبان الفردية، يمكن أن تنشأ المزيد من القضايا في ملاءمتها مع النماذج المعروضة في قسم البروتوكول. لا بد أن تدرس بعناية صالح إلى التفكك معادلة ثابتة باستخدام مقياس لوغاريتمي، وهذا التحليل غالبا ما يبرز تناقضات بين البيانات احظ ونموذج (ه .G.، الشكل 3). في حين أن النتائج التي تم الحصول عليها هي قوية بشكل عام والرعاية في التفسير يتيح الفرصة لاستخلاص أفضل النتائج، والأكثر معنى، من البيانات.
وهناك قضية معينة تثيرها هذه البيانات هو التفسير الذي ينبغي أن توضع على البروتينات التي تظهر cooperativity، أو الأحداث ملزمة متعددة، في مهرجان دبي للتسوق. قمنا حتى الآن، لاحظ فقط هذه الظاهرة في البروتينات التي من المتوقع أن يكون لديك عدة أحداث ملزمة محددة (على سبيل المثال، WcbM، وهو بروتين الذي هو متعدد القسيمات 26 نديد أفضل، والذي يعمل بمثابة متعدد القسيمات على استبعاد حجم اللوني [البيانات لاأظهرت]). فإنه ليس من الواضح على الإطلاق أن cooperativity السلبية التي لوحظت في مهرجان دبي للتسوق تمسخ إلى أن إنزيم سوف تظهر في نهاية المطاف cooperativity سلبية: بدلا من ذلك، وهذا قد يكون مؤشرا ملزمة مجمع التي يجب استكشافها أكثر شمولا باستخدام مجموعة واسعة من الأساليب. هذا لا يوحي لنا، مع ذلك، أن دراسات أوسع لهذه البروتينات من المحتمل أن تحديد تأثيرات مثيرة للاهتمام.
القيم المعطاة للثابت التفكك باستخدام هذه الطريقة عادة ما تكون من نفس النظام وتلك التي توفرها أساليب أخرى، مثل قياس الكالوري المعايرة متساوي الحرارة ومأكل سطح الرنين. ومع ذلك، فإن القيم المطلقة لوحظ أعلى كثيرا مما لوحظ استخدام هذه الأساليب. هذا هو على الأقل جزئيا نتيجة لحقيقة أن لوحظ ثابت التفكك في درجة حرارة انصهار من البروتين مع يجند. هذا K د عموما أعلى من ذلك في درجات حرارة الفسيولوجية. وdissociatioن الثابت هي ذات الصلة إلى درجة حرارة رد فعل من جانب المعادلات:
[1]
[2]
(حيث c θ هو تركيز المرجعية القياسية، Δ ص G هو التغيير طاقة جيبس الحرة للتفاعل، R هو ثابت الغاز المولي، Δ H هو التغير في المحتوى الحراري للتفاعل، وΔ S هو التغيير الكون في رد فعل .)
سوف ردود الفعل مع ثوابت التفكك في نطاق قياس هذه الطريقة عادة يكون سلبي Δ ص G، وبالتالي فإن تأثير زيادة في درجة الحرارة على المعادلة [1] سيكون لزيادة التفكك المستمر. كل من Δ H Δ S والمصطلحات التي تشكل الطاقة الحرة جيبس (المعادلة [2]) ودرجة حرارةسوف يعتمد 27 ه، والتأثير على ثابت التفكك تعتمد على حجم وعلامة من هذه التبعيات درجة الحرارة، وسيكون بالضرورة إحداث تفاعل بين الجسيمات التابع. وبالتالي، فإنه ليس من غير المتوقع أن ثوابت التفكك تحددها هذه الطريقة هي أكبر أحيانا من تلك التي يحددها الأساليب التي تعمل على RT. درجة حرارة الاعتماد هو، بطبيعة الحال، أيضا التحذير من طرق أخرى كثيرة، والتي تميل إلى توفير ثابت التفكك في درجات حرارة أقل من درجة حرارة الفسيولوجية.
تحذير آخر من طريقة مهرجان دبي للتسوق هو أنه وسيلة المسمى، خلافا ITC. التسمية الفلورسنت المستخدمة (SYPRO البرتقال) هي مسعور، وحتى في بعض الحالات يمكن أن تتنافس مع ربط بروابط مسعور إلى البروتينات. وبالتالي، فمن المرجح أنه في بعض الحالات، ثابت التفكك الحصول عليها سيتم رفع مصطنع بسبب المنافسة مع التسمية. ومع ذلك، لمقارنة بروابط متنوعة، (الاستخدام الرئيسي للDSF)، من غير المرجح أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية للتأثير على الترتيب من المركبات التي تقارب الاختلافات.
والعيب المحتمل لهذا الأسلوب هو الحد من الكشف الذي يمكن تحقيقه. من حيث المبدأ، فإنه لا ينبغي أن يكون من الممكن قياس بدقة قيمة K د أن أقل من 50٪ من تركيز البروتين، وحتى القيم في هذا النطاق من المحتمل أن تكون ذات دقة مشكوك فيها. في حين أن الحد من الكشف في نهاية هذا النطاق يمكن تمديدها قليلا عن طريق خفض تركيزات البروتين وصبغ، فإن حساسية الصك منع مزيد من الانخفاض في تركيز البروتين. وبالمثل، سيتم تحديد نهاية العلوي من حساسية من قبل ذوبان يجند. للحصول على تقدير قوي رياضيا لK د، ومن المهم للغاية للحصول على البيانات مع 90٪ من البروتين موجودة في شكل محدد يجند، الأمر الذي يتطلب تركيز يجند أن تكون تقريبيةلاي عشر مرات K د (بافتراض عدم cooperativity). وبالتالي فإن الحد من الكشف بالضرورة عشر ذوبان يجند في المخزن المؤقت ذات الصلة. هذا يعني أن حدود الكشف عن الطريقة سوف تتراوح عادة بين 1 ميكرومتر وبين 1 و 100 ملم، اعتمادا على البروتين ويجند.
في الختام، المسح التفاضلي fluorimetry هي تقنية متعددة الاستعمالات التي تنطبق على مجموعة واسعة من البروتينات. باستخدام الأساليب المعروضة هنا، فمن الممكن لتحديد بسرعة وبتكلفة زهيدة تقارب من البروتين للبروابط مختلفة. هذه لديها امكانات كبيرة لتطبيقها في تنقية البروتين والاستقرار، توضيح وظيفة أو خصوصية الانزيمات من metagenomes، واكتشاف المخدرات، وخاصة في المختبرات الصغيرة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.
Materials
| StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
| Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
| Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
| U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
| SPSS statistics version 20 | IBM | N/A | Other statistics packages will provide similar functionality |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | N/A | Other statistics packages will provide similar functionality |
| Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher scientific | 10141520 |
Referências
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Ladbury, J. E. Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design. Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).
- Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering. Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).
- Davis, B. J., Erlanson, D. A. Learning from our mistakes: the ‘unknown knowns’ in fragment screening. Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).
- Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery. Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).
- Scott, D. E., et al. Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions. Chembiochem. 14, 332-342 (2013).
- Cimmperman, P., et al. A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands. Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).
- Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor. Bioquímica. 44, 5258-5266 (2005).
- Zubriene, A., et al. Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay – radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII. Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11, 835-841 (1997).
- Cuccui, J., et al. Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region. Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).
- DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant. Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).
- Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme. IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).
- Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein. J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).
- Uniewicz, K. A., et al. Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity. Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).
- Wan, K. F., et al. Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL. Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).
- Koropatkin, N. M., Holden, H. M. Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi. J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).
- Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB. J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).
