逆转录病毒感染的原发性肠化培养的视频协议

在以下协议中使用的所有老鼠被安放在无特定病原体条件下，所有的程序都根据英国内政部的规定执行。 1，准备工作准备媒体1小时提前使用（ 见表1和材料清单详细介绍）和预暖在37℃水浴中至少10分钟后再使用。 2，培养小肠（SI）的组织体注意：除非另有说明，所有的孵育均在加湿培养箱中于37℃，5％CO 2中进行。设备和试剂进入与活细胞接触必须是无菌的。 预暖的组织培养板中是很重要的，因为它可以防止地下室基质（基质胶或BME）的水滴从播种时撒出。另外，地下室基质应保持在冰上在任何时候。储存于-20°C和解冻在使用前冰。 隔离囊对于小肠隔离按照国家的规章制度牺牲小鼠，然后放置在其背面的动物，并用70％乙醇的腹部。从腹股沟到胸骨进行纵向正中切口。首先，切开皮肤，然后皮下组织。从盲肠到胃中取出小肠。隐窝从十二指肠，空肠和回肠中分离，可用于类器官培养。 不含钙或镁（PBS0）洗分离小肠预冷磷酸盐缓冲盐水。 切割组织成3-5厘米长的小段，并用剪刀剖开纵向。使用镊子传播组织。 刮去用盖玻片绒毛。注意，过多的力会导致组织撕裂，并会减少在下面的步骤隐窝的产率。 转移组织到50ml管含有预冷却PBS0使用设克钳。经过剧烈摇晃清洗组织碎片，改变PBS0。重复2-3倍，或直至PBS0匝数较少多云。 孵育于50ml管装有30ml PBS0的用1mM乙二胺四乙酸（EDTA）处理30分钟，在4℃下在管式辊的组织。 用力摇动该管和所述组织转移到另一个50ml管中含有用5mM EDTA30毫升PBS0的。在1mM EDTA的溶液（预先含有组织）将包含隐窝和绒毛的混合物。该馏分是不适合组织体的播种，因为它通常包含绒毛的高百分比。 在4℃下孵育所述组织进一步进行1小时的管子辊。 大力摇晃试管，并收集在干净的50ml管中的解决方案。确认隐窝的存在并估计数， 例如 ，通过用光学显微镜计数在50μl隐窝。计算需要获得50-100隐窝，并将其转移到1.5 ml吨的量UBE。 转速为300×g离心5分钟。弃去上清液，沉淀重悬在50μl地下室矩阵，以及种子中的预温热的24孔板中。孵育板在组织培养箱5-15分钟让地下室矩阵聚合。 覆盖用500μlENR介质（ 见表1）。无欲无求的组织体将呈现一个小的圆形囊性形状后，又经过2-3天出芽结构约24小时可见。切换到新鲜ENR媒体每3天。 通道类器官培养，每7天。 传代和维护类器官通过刷新媒体，每3天传代1保持的组织体：3或1:5作为管腔变得充满死亡的细胞，约每7天。 打破地下室矩阵圆顶与用1ml的Pipetman尖介质和从井将其传送到1.5ml管中。 机械地分解，通过移液管的组织体pproximately使用50倍的罚款 ​​（ 如 ，200微升）一角。 转速为300×g离心5分钟。 弃上清，悬浮颗粒在150-250微升地下室矩阵。种子在预先温热的24孔板（50μl的地下室矩阵/孔）。前播种吸管地下室矩阵上下一次涂覆的尖端的壁。移液管缓慢，以避免在井中的中间，以防止基底基质扩散出来的气泡和种子。人们希望得到地下室矩阵的圆顶在井的中心。 在孵育组织培养箱5-15分钟让地下室矩阵聚合。覆盖层中，每孔500微升ENR媒体。 3，预先感染SI类器官的治疗注意： 图1示出了转导过程。 外汇ENR到ENRWntNic（ 见表1）中，成长类器官在T他的媒介最少3天，直到它们都采用了胆囊形态。 Wnt3a的增加茎和帕内特细胞的数目，而烟酰胺（NIC），提高了培养效率。 4，病毒制作铂E细胞的1个150毫米的菜是需要每个感染。种子约5×10 6个细胞用15-18毫升培养基（DMEM + 10％FBS）中嘌呤霉素（1微克/毫升）和杀稻瘟素（10微克/毫升）的存在下进行。 2-3天后转染细胞，当他们达到70-80％汇合。无嘌呤和转染前瘟改变介质的DMEM + 10％FBS中。 加30的逆转录病毒DNA构建体的微克和240微升的聚乙烯亚胺（PEI）来分离含有1ml OPTI-MEM中的试管中。混合并在室温下孵育5分钟。 普尔两种溶液并在室温下孵育20-30分钟。完整的混合物加入铂E细胞的培养基中，小心摇动高原E要确保DNA-PEI复合物的均匀分布。 孵育铂E细胞的转染混合物过夜，刷新了媒体的第二天。使细胞保持在新的培养基中2天。 只收集在50毫升猎鹰管中，用0.45微米的过滤器和离心机在8000 XG通过它在4℃下12-16小时。弃去上清，重悬在250μl的转导介质的粒料（ 见表1）。 5类器官片段的制备一个感染的24孔板一个孔是必要的。打破地下室矩阵圆顶与用1ml的Pipetman尖中，转移到1.5 ml管。 使用体积更细尖（ 例如 ，200微升提示），通过移液（30-50x）机械地破坏组织体。该解决方案将变得浑浊，没有整个组织体应该是可见的。 离心机在室温下，900×g离心5分钟 。 弃上清，悬浮颗粒在500微升的细胞培养级重组蛋白酶（ 如的TrypLE）。在37℃下加热5分钟。温育后检查用光学显微镜的组织体片段的大小，计数每片段的细胞数。含5-10个细胞碎片的理想选择。如果多数片段包含多个小区的更高的温育时间可以在同一时间被增加2分钟。 加入500微升的ENR介质终止解离过程。 离心机在室温下，900×g离心5分钟。除去上清液，并保持颗粒冰或4℃。 6逆转录病毒转导结合类器官片段与250μL的48孔板的一个孔中的逆转录病毒解决方案（从第4.5节）的。缓慢的移液用1ml的Pipetman尖轻轻混匀。 封板用封口膜。 E“> 7。Spinoculation和电镀离心反应板在32℃，600 XG，1小时。小心地取出封口膜孵育板在组织培养箱6小时。 8，播种感染类器官片段从井中转移感染类器官片段和传导介质到1.5ml管中，并旋在900×g离心5分钟。 弃去上清液，把含在冰上沉淀的管5分钟，冷却。加入100μl地下室矩阵的和缓慢上下吹打重悬沉淀。 种子滴50微升的地下室矩阵β细胞混合“在一个新的24孔板中。孵育板在37℃下进行5-15分钟，直到基底基质固化。 不添加聚凝胺传导介质井和孵化盘在组织培养的孵化器。更换介质每2-3天。 9，选择 SE开始2-3天后，加入嘌呤霉素（1微克/毫升）对媒体经文。 当该片段开始形成类器官用补充有嘌呤霉素（1微克/毫升）的ENR媒体更换转导介质。 10，感染后的SI类器官的治疗根据“传代并保持组织体”的协议（第2.2.1节）文化转类器官。 1-2周后，SI类器官将重拾萌芽结构。 以下出芽结构的外观通过在1μM的工作浓度加入4 – 羟基他莫昔（4-OHT）诱导的miRNA或cDNA的表达。请注意，此步骤仅当使用逆转录病毒载体，从Addgene（的pMSCV-loxP的红色荧光-loxP的EGFP-普罗-WPRE（32702）的pMSCV-loxP的红色荧光-loxP的3xHA – 普罗-WPRE（32703），和的pMSCV有效-flip – 普罗 – 红色荧光-GFP-miRNA的（32704））和类器官表达Cre-ERT2。 11。确认感染与expr的分裂国家/抑制利率的基因如果使用的逆转录病毒载体，从Addgene（32702，32703及32704）转导效率可以通过观察红色荧光表达的证实。此外，所关注的基因的表达或抑制可以通过Western印迹证实，使用GFP或3xHA表位（用于基因表达）和定量PCR（基因敲除），例举在辜等人 4。