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Biologia

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

Published: August 11, 2014
doi:
10.3791/51765
, , ,
1Department of Genetics,University of Cambridge, 2Wellcome Trust – Medical Research Council Stem Cell Institute,University of Cambridge

Summary

Questo protocollo spiega cultura organoide Lgr5-positivo primaria e la successiva esecuzione di trasduzione retrovirale. Ciò consente sovraespressione Cre-inducibile o knockdown del transgene consegnato e permette studi funzionali da realizzare nel romanzo in vitro organotipica sistema modello.

Abstract

Cellule staminali Lgr5-positivi possono essere integrati con la crescita essenziale fattori FEG Noggin, e R-spondina, che ci permette di cultura in continua espansione delle strutture epiteliali 3D primarie in vitro. Sia l'architettura e fisiologiche proprietà di questi "mini-coraggio", chiamati anche organoidi, molto simili alle loro controparti in vivo. Questo li rende un sistema modello interessante per le piccole epitelio intestinale fa. Utilizzando trasduzione retrovirale, la genetica funzionali possono ora essere eseguite da sovraespressione del gene condizionale o knockdown. Questo video illustra la procedura di cultura organoide, la generazione dei retrovirus, e la trasduzione retrovirale di organoidi per assistere analisi fenotipica del piccolo epitelio intestinale in vitro. Questo nuovo sistema modello organotipica in combinazione con l'espressione retrovirale genica mediata fornisce un valido strumento per una rapida analisi della funzione genica in vitro senza bisogno di costlGenerazione Y e in termini di tempo per gli animali transgenici.

Introduction

High-throughput genetica funzionali è necessario per aumentare la nostra comprensione biologica del corpo, per migliorare la corrente di scienza di base e la medicina. Genetica del mouse è stato il gold standard per lo studio della funzione genica in vivo, anche se è sia in termini di tempo e costosa. Le linee cellulari, essendo l'altra scelta comune, hanno pur essendo meno costoso di una maggiore capacità di throughput. Tuttavia, essi sono impediti dalla loro incapacità di riprodurre il corretto microambiente e quindi le risposte fisiologiche visto in vivo. Quindi, vi è una necessità univoca per un facile da maneggiare sistema modello, che permette di costo / tempo-efficiente high throughput analisi mentre imitando le risposte fisiologiche osservate in vivo esperimenti transgenici (Tg) del mouse in.

Per l'epitelio endodermico un tale sistema modello apparso nel 2009 1. Tra le conoscenze acquisite con la scoperta delle cellule staminali intestinali Lgr5-positivi è statainformazioni sulla nicchia corrispondente ai fattori extracellulari della matrice e crescita necessarie per la manutenzione delle cellule staminali. Utilizzando queste informazioni è stato possibile stabilire "mini-guts 'noto anche come organoidi 2. Recentemente una nomenclatura consenso per le culture in vitro, dove organoidi sono indicati come "enteroids", è stato suggerito 3. Come linee cellulari, le organoidi sono in continua espansione e facile da trattare con leganti e inibitori. Tuttavia, invece di essere bidimensionali sono strutture tridimensionali di auto-organizzazione che mantengono l'organizzazione cripta-villo così come le cellule staminali e linee cellulari differenziate del piccolo intestino (SI). Organoidi costituiti da un singolo strato di cellule epiteliali che circondano un'area luminale. Sporgenti strutture in erba corrispondono alle piccole cripte intestinali contenenti compartimento delle cellule staminali. Partendo dalla punta della struttura germogliamento cellule progenitrici differenziano in quanto MIgrattugiare verso il rivestimento epiteliale, dove le cellule terminalmente differenziate sono capannone nel lume. Rispetto a linee cellulari, questo sistema ex vivo ricapitola più strettamente la normale fisiologia ed è quindi un sistema modello promettente per la piccola epitelio intestinale.

In questo protocollo video di trasduzione retrovirale, vi presentiamo un metodo che consente di ex vivo studi di funzione genica in questo romanzo sistema di coltura organoide. Iniziamo descrivendo organoide cultura in un modo step-by-step, e continuiamo dimostrando la generazione di retrovirus seguita dalla procedura di trasduzione. Infine, vi è una sezione per ulteriori consigli per la risoluzione dei problemi. Un vantaggio di questa tecnica è che può essere combinato con l'imaging dal vivo o screening di farmaci per studiare omeostasi, decisioni destino delle cellule e le interazioni cellula-cellula a livello dell'epitelio intestinale. Grazie alla loro architettura semplice e tasso di turnover veloce, organoidi rappresentano un modello ideale system per lo studio della biologia delle cellule staminali adulte. Inoltre trasduzione retrovirale può essere applicato a organoidi derivate da topi transgenici prestabiliti nonché campioni umani dei pazienti. Con l'avvicinarsi del knock-in e knock-out non possono essere estesi agli esseri umani, i organoidi umano SI costituiscono un'alternativa attraente.

In sintesi, la manipolazione genetica attraverso la trasduzione retrovirale permette l'analisi fenotipica in piccoli organoidi intestinali derivati ​​da topi o campioni di tessuti umani, integrando in tal modo la genetica del mouse e linee cellulari durante l'apertura di nuove strade per gli studi nei tessuti di derivazione umana. Trasduzione retrovirale consente GAIN- e la perdita-di-funzione studi da eseguire nel sistema di coltura organoide 4. Questo lo rende una risorsa preziosa per lo studio della funzione genica, adulto biologia delle cellule staminali e la malattia pur essendo in conformità con le tre R (riduzione, perfezionamento e sostituzione).

Protocol

Tutti i topi utilizzati nel seguente protocollo sono stati tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutte le procedure sono state eseguite secondo le norme Regno Unito Casa di Office. 1 Preparazione Preparare supporti 1 ora in anticipo di utilizzo (vedi Tabella 1 e la Lista dei Materiali per maggiori dettagli) e pre-caldo in un bagno di 37 ° C acqua almeno 10 minuti prima dell'uso. 2. Coltura Piccolo intestinale (SI) organoidi NOTA: Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni vengono eseguite a 37 ° C, 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Attrezzature e reagenti che entrano in contatto con le cellule viventi devono essere sterili. Pre-riscaldamento della piastra di coltura tissutale è importante in quanto previene la matrice seminterrato (Matrigel o BME) scende da diffondere quando semina. Inoltre, la matrice basamento deve essere mantenuto in ghiaccio in ogni momento. Conservare a -20 ° C e disgeloin ghiaccio prima dell'uso. Isolamento cripte Per l'isolamento del piccolo intestino sacrificare il mouse in base alle norme e ai regolamenti nazionali, quindi posizionare l'animale sul dorso e lavare l'addome con il 70% di etanolo. Eseguire una linea mediana incisione longitudinale dall'inguine allo sterno. In primo luogo, tagliare la pelle e quindi il tessuto sottocutaneo. Rimuovere il piccolo intestino cieco allo stomaco. Cripte isolati dal duodeno, digiuno e ileo possono essere utilizzati per la coltura organoide. Lavare il piccolo intestino isolato con pre-raffreddata Phosphate-Buffered Saline senza calcio e magnesio (PBS0). Tagliare il tessuto in pezzi lunghi 3-5 cm e usare le forbici per tagliare aprire longitudinalmente. Stendere il tessuto utilizzando una pinza. Raschiare villi con un coprioggetto. Attenzione, troppa forza causerà il tessuto di strappare e ridurrà la resa delle cripte nel seguire passaggi. Trasferire il tessuto in una provetta da 50 ml contenente pre-raffreddata PBS0 Strug pinze. Lavare i frammenti di tessuto attraverso vigorosa agitazione e cambiare il PBS0. Ripetere 2-3 volte o fino a quando il PBS0 diventa meno nuvoloso. Incubare il tessuto in una provetta da 50 ml contenente 30 ml di PBS0 di 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 30 min a 4 ° C su un rullo tubo. Agitare vigorosamente la provetta e trasferire il tessuto ad un altro tubo da 50 ml contenente 30 ml di PBS0 con 5 mM EDTA. La soluzione 1 mM EDTA (precedentemente contenente il tessuto) conterrà una miscela di cripte e villi. Questa frazione non è adatto per la semina di organoidi quanto spesso contiene un'alta percentuale di villi. Incubare il tessuto ulteriormente per 1 ora a 4 ° C su un rullo tubo. Agitare vigorosamente il tubo e raccogliere la soluzione in una provetta pulita da 50 ml. Confermare la presenza di cripte e di stimare il numero, ad esempio, contando cripte in 50 microlitri al microscopio ottico. Calcolare il volume necessario per ottenere 50-100 cripte e trasferirlo ad un 1,5 ml tube. Spin a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 50 ml di matrice seminterrato, e le sementi in una piastra a 24 pozzetti pre-riscaldato. Incubare la piastra in un tessuto cultura incubatore per 5-15 minuti in modo che la matrice seminterrato polimerizza. Overlay con 500 microlitri di media ENR (vedi Tabella 1). Circa 24 ore dopo la semina i organoidi mostrerà una piccola forma cistica rotonda e dopo altri 2-3 giorni in erba strutture diventano visibili. Modificare i media ENR freschi ogni 3 giorni. Passaggio organoide culture ogni 7 giorni. Passaging e organoidi Gestione Mantenere le organoidi aggiornando media ogni 3 giorni e il passaggio 1: 3 o 1: 5, come il lume si riempie di cellule morte, circa ogni 7 giorni. Rompere la cupola matrice seminterrato con media usando 1 ml di punta Pipetman e trasferirlo dal pozzo in una provetta da 1,5 ml. Meccanicamente dissociare le organoidi attraverso un pipettaggiopproximately 50x con una multa (ad esempio, 200 ml) punta. Spin a 300 xg per 5 min. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 150-250 ml di matrice seminterrato. Seed in un pre-riscaldato 24 pozzetti (50 ml di matrice seminterrato / e). Prima della semina pipetta matrice seminterrato su e giù una volta per rivestire la parete della punta. Pipetta lentamente per evitare bolle e seme nel mezzo del pozzo per evitare che la matrice seminterrato diffusione fuori. Si desidera ottenere una cupola di matrice interrato nel centro del pozzo. Incubare in un tessuto cultura incubatore per 5-15 minuti in modo che la matrice seminterrato polimerizza. Overlay con 500 microlitri ENR supporto per pozzetto. 3 Pre-Trattamento di infezione SI organoidi NOTA: La figura 1 illustra la procedura di trasduzione. Scambio ENR per ENRWntNic (vedi Tabella 1) medio e crescono le organoidi in til suo mezzo per un minimo di 3 giorni o fino a che non hanno adottato una morfologia cistica. Wnt3a aumenta il numero di cellule staminali e di Paneth mentre Nicotinamide (Nic) migliora l'efficienza cultura. 4. Virus Produzione È necessario uno a 150 mm piatto di cellule Platinum-E per l'infezione. Seme di circa 5 x 10 6 cellule con 15-18 ml di supporti (DMEM + 10% FBS) in presenza di puromicina (1 mg / ml) e blasticidin (10 mcg / ml). Trasfezione le cellule dopo 2-3 giorni, quando hanno raggiunto il 70-80% di confluenza. Modificare il medio DMEM + 10% FBS, senza puromicina e blasticidin prima di trasfezione. Aggiungere 30 mg di costrutto di DNA retrovirale e 240 ml di polietilenimmina (PEI) per separare le provette contenenti 1 ml di Opti-MEM. Mescolare ed incubare a temperatura ambiente per 5 min. Si riuniscono le due soluzioni ed incubare a temperatura ambiente per 20-30 min. Aggiungere la miscela completa al mezzo di cellule Platinum-E e agitare accuratamente il plate al fine di garantire un'equa distribuzione dei complessi DNA-PEI. Incubare le cellule Platinum-E con la miscela di trasfezione durante la notte e aggiornare il medio il giorno seguente. Conservare le cellule del nuovo mezzo per 2 giorni. Raccogliere solo il mezzo in un tubo Falcon da 50 ml, passa attraverso un filtro da 0,45 micron e centrifugare a 8000 xga 4 ° C per 12-16 ore. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 250 ml di trasduzione media (vedi Tabella 1). 5. organoide Frammento Preparazione Per una infezione è necessario un pozzetto da una piastra da 24 pozzetti. Rompere la cupola matrice seminterrato con media usando 1 ml di punta Pipetman e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml. Utilizzare una punta di volume più fine (ad esempio, 200 consigli microlitri) per distruggere meccanicamente i organoidi attraverso pipettaggio (30-50x). La soluzione diventerà torbida e non interi organoidi dovrebbe essere visibile. Centrifugare a temperatura ambiente, 900 xg per 5 min . Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 500 ml di coltura cellulare di grado proteasi ricombinante (ad esempio, TrypLE). Incubare a 37 ° C per 5 min. Dopo incubazione verificare la dimensione dei frammenti organoide utilizzando la microscopia ottica, contando il numero di cellule per frammento. Frammenti contenenti 5-10 cellule sono l'ideale. Se la maggior parte dei frammenti contiene un numero elevato di celle del tempo di incubazione può essere aumentata di 2 minuti alla volta. Terminare il processo di dissociazione con l'aggiunta di 500 ml di ENR media. Centrifugare a temperatura ambiente, 900 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet in ghiaccio o 4 ° C. 6. trasduzione retrovirale Unire frammenti organoide con 250 microlitri della soluzione retrovirale (da paragrafo 4.5) in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Mescolare delicatamente pipettando lento utilizzando 1 ml di punta Pipetman. Sigillare la piastra con Parafilm. e "> 7. Spinoculation e placcatura Centrifugare la piastra a 32 ° C, 600 xg, per 1 ora. Rimuovere con attenzione il Parafilm e incubare la piastra in un tessuto cultura incubatore per 6 ore. 8 Semina di infetti organoide Frammenti Trasferire i frammenti organoide infetti e media trasduzione dal pozzo in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 900 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e mettere il tubo contenente il pellet in ghiaccio per 5 minuti a raffreddare. Aggiungere 100 ml di matrice seminterrato e risospendere il pellet pipettando lentamente su e giù. Gocce di semi di 'interrato matrice -cell mix' di 50 microlitri di una nuova piastra da 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C per 5-15 minuti fino a quando i solidifica matrice seminterrato. Aggiungi mezzi di trasduzione, senza polibrene ai pozzetti e incubare la piastra in un incubatore coltura di tessuti. Modificare i media ogni 2-3 giorni. 9 Selezione Inizia SEcolta dopo 2-3 giorni con l'aggiunta puromicina (1 mg / ml) per il supporto. Quando i frammenti stanno iniziando a formare organoidi sostituire il supporto di trasduzione con i media ENR integrato con puromicina (1 mg / ml). 10 post-infezione Trattamento di SI organoidi Cultura trasduzione organoidi secondo il "Passaging e mantenere organoidi" protocollo (punto 2.2.1). Dopo 1-2 settimane i organoidi SI potranno ritrovare le loro strutture in erba. A seguito della comparsa di strutture in erba indurre l'espressione di miRNA o cDNA aggiungendo 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) in una concentrazione di 1 mM di lavoro. Si noti che questo passo è valida solo se si utilizza vettori retrovirali da Addgene (pMSCV-loxp-DsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxp-DsRed-loxp-3xHA-Puro-WPRE (32703), e pMSCV -flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) e organoidi esprimono Cre-ERT2. 11 Conferma di infezione e ExprESSIONE / Soppressione del gene di interesse Se si utilizzano vettori retrovirali da Addgene (32702, 32703 e 32704) efficienza di trasduzione può essere confermata dall'osservazione di espressione DsRed. Inoltre, l'espressione o la soppressione del gene di interesse possono essere confermati dal Western Blot, utilizzando la GFP o 3xHA epitopo (per la sovraespressione del gene) e qPCR (per gene knockdown), come esemplificato nella Koo et al 4.

Representative Results

Organoidi sono pronti per essere raggruppati quando il lume centrale è oscurato a causa della presenza di cellule morte (Figura 2). Dopo 2-3 giorni di organoidi pre-trattamento dovrebbe adottare una morfologia cistica turno (Figura 3). Questo aumenta il numero di cellule staminali, aumentando le possibilità di ottenere integrazione stabile. Le dimensioni del pellet virale può variare dalla centrifugazione del surnatante virale, molto probabilmente a causa di variazioni contributo di detriti cellulari alle dimensioni del pellet. È stata osservata alcuna chiara correlazione di efficienza di trasduzione. Durante la procedura di selezione organoidi non trasdotte moriranno, mentre quelle con una integrazione stabile rimarrà. La proteina fluorescente da retrovirus MSCV-eGFP può essere osservato in cellule provenienti da organoidi superstiti, che hanno una morfologia cistica, entro 2-3 giorni dopo la trasduzione (Figura 4). <img alt = "Figura 1" fo: content-width = "src" "6in" = "/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg" width = "600" /> Figura 1 Un disegno schematico della procedura di trasduzione retrovirale. Prima di organoidi infezione sono pre-trattati con ENRWntNic fino a che non adottano una struttura cistica (step 1). Cellule Platinum-E sono utilizzati come la linea cellulare di packaging, e sono coltivate fino a raggiungere il 70-80% di confluenza. Successivamente vengono trasfettate con il costrutto retrovirale con PEI. I virus sono raccolte 2 giorni più tardi (fase 2). Organoidi sono tripsinizzate per ottenere frammenti contenenti 1-10 cellule (fase 3), e vengono quindi infettate (punto 4). Dopo spinoculation per aumentare l'efficienza di infezione (punto 5), i frammenti organoide infetti vengono seminate (fase 6) e 2-3 giorni dopo la selezione di cloni positivi con l'integrazione stabile può essere eseguita (punto 7). 1765fig2highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 2 Immagine rappresentativa della organoidi dopo 4-6 giorni di coltura. Il lume è pieno di cellule morte, facendolo apparire scuro. Organoidi in questa fase sono pronti per essere diversi passaggi. Figura 3 Immagine rappresentativa di piccoli organoidi intestinali coltivate in ENRWntNic mezzi per 3-4 giorni. Le organoidi adottare una morfologia cistica. Figura 4 Immagine rappresentativa di piccoli organoidi intestinali (a) che mostrano l'espressione del transgene virale (B, eGFP). Advanced DMEM / F12 +++ Conservare a 4 ° C per 4 settimane Avanzato DMEM / F12 500 ml Glutamax 100x 5 ml Hepes 1 M 5 ml Antibiotici 100x 5 ml Mezzo ENRWntNic (per 20 ml) Conservare a 4 ° C per 2 settimane Avanzato DMEM / F12 +++ 7.2 ml Supplemento B27 (50x) 400 microlitri N2 supplemento (100x) 200 ml N-acetilcisteina (500 mm) 50 microlitri topo EGF (500 mg / ml) 2 microlitri Noggin topo (100 mg / ml) 20 microlitri R-spondina Conditioned medio 2 ml Wnt3a terreno condizionato 10 ml Nicotinamide (1 M) 200 ml Mezzo di trasduzione (20 ml) Preparare fresco ENRWntNic medio 20 ml Y-27632 (10 micron) 20 microlitri Polybrene (8 mg / ml) 20 microlitri ENR mezzo (20 ml) Conservare a 4 ° C per 4 settimane Avanzato DMEM / F12 +++ 17.4 ml Supplemento B27 (50x) 400 microlitri N2 supplemento (100x) 200 ml N-acetilcisteina (500 mm) 50 microlitri </td> topo EGF (500 mg / ml) 2 microlitri Noggin topo (100 mg / ml) 20 microlitri R-spondina terreno condizionato 2 ml Supporti per le celle Platinum-E (per 500 ml) Conservare a 4 ° C per 12 settimane DMEM 449,45 ml Siero fetale bovino (FBS) 50 ml Puromicina (1 mg / ml) 50 microlitri Blasticidin (10 mg / ml) 500 microlitri Tabella 1. composizione media avanzata DMEM / F12 +++, ENRWntNic medio, medio trasduzione, ENR media, e medio per le cellule Platinum-E.

Discussion

Per ottenere alta efficienza di trasduzione alcuni aspetti sono fondamentali. Uno è il pre-trattamento dei organoidi con ENRWntNic supporti fino a che non adottano una forma cistica rotonda. Questo aumenta il numero di cellule staminali e quindi la possibilità di ottenere una integrazione stabile del transgene, oltre ad aumentare il tasso di sopravvivenza dei organoidi SI tutta la procedura di trasduzione. Un altro parametro è il tempo di incubazione seguente spinoculation. Risultati di incubazione troppo corto o troppo lungo in cattiva efficienza di trasduzione e la scarsa sopravvivenza dei organoidi rispettivamente. Il passo spinoculation non è essenziale anche se aumenta significativamente la percentuale di organoidi trasdotte. Infine, il virus ad alto titolo è la chiave per la trasduzione di successo. Questo dipende dal tipo di linea cellulare di packaging e virus. La combinazione della linea cellulare Platinum-E e murina virus di cellule staminali (MSCV), è stato trovato per produrre un titolo abbastanza alto per la trasduzione di organoidi.

ve_content "> Di seguito sono riportati suggerimenti per la risoluzione dei problemi che possono contribuire al raggiungimento di trasduzione di successo. Innanzitutto, se la trasfezione della linea cellulare di packaging è scarsa, assicurarsi che la confluenza delle cellule è tra il 70-80% e che il tempo di incubazione della miscela pool PEI-DNA è tra 20-30 min. La sopravvivenza dei organoidi durante trasduzione altamente dipende dalla dimensione del frammento. Troppo lungo tripsinizzazione causa la maggior parte dei frammenti di consistere in meno di 3 cellule e di conseguenza diminuisce la sopravvivenza organoide. altro fattore è l'attività del mezzo Wnt condizionato, se l'attività è troppo basso amplificando attraverso aggiunta di CHIR99021 in una concentrazione di lavoro di 5 micron possono aumentare la sopravvivenza. CHIR99021 inibisce GSK3, con conseguente aumento di segnalazione Wnt. Inoltre, Y-27362, che impedisce anoikis si aggiunge ai media di trasduzione per migliorare la sopravvivenza organoide, dal momento che i organoidi sono interrotti a frammenti (contenenti 1-10 cellule) prima di trasduzione. come60, citato sopra, il tempo di incubazione dopo spinoculation non deve superare i 6 ore. Infine, se il povero trasduzione si osserva dovrebbero essere considerati i fattori di cui sopra che influenzano il titolo virale e il limite di dimensione dell'inserto per il vettore retrovirale. L'efficienza del knockdown è fortemente dipendente dalla miRNA. Poiché l'efficienza varia con la combinazione del gene bersaglio e miRNA è opportuno eseguire una schermata efficienza per identificare quelli che funzionano meglio.

La tecnica è limitata ai fenomeni epiteliali del sistema organoide. In futuro potrebbe essere possibile studiare malattie infettive o immuno-mediate attraverso la co-coltura di patogeni o di ricostituzione con componenti derivati ​​dal sistema immunitario, rispettivamente. Inoltre, i retrovirus possono trasportare solo inserti di dimensioni relativamente ridotte. Di conseguenza, naturali regioni regolatorie devono essere esclusi e quindi l'espressione del transgene non può imitare quella diil gene endogeno. Come accennato in precedenza, l'efficienza atterramento dipende dal gene bersaglio e miRNA. Se nessun miRNA con idoneo efficienza smontabile può essere giudicata può limitare l'uso della tecnica per quel particolare gene bersaglio.

Teoricamente, organoidi sono compatibili con tutte le tecniche manipolative standardizzate utilizzate per linee cellulari. Trasduzione retrovirale è stato il primo metodo da segnalare 4, e recentemente BAC (cromosoma artificiale batterico) -transgenesis è diventato disponibile 5. Con un tempo totale di generazione di 2-3 settimane, dopo trasfezione del plasmide virale nella linea cellulare di packaging, è significativamente più veloce rispetto alla generazione di un transgenico (tg) topo. Mantenendo in vivo cripta-villo architettura mentre contenente cellule staminali così come tutte le linee cellulari differenziate dell'epitelio intestinale, il sistema di coltura organoide colma il divario tra tg animali e colture cellulari precedentemente utilizzato.

<pclass = "jove_content"> Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per eseguire l'analisi fenotipica di epitelio endodermico in vitro attraverso GAIN- e in perdita di studi di funzione. Ciò rende possibile affrontare questioni fisiologicamente rilevanti in adulto biologia delle cellule staminali, con un bisogno minimo di topi tg. Ad esempio, la generazione di topi knockout condizionali potrebbe essere evitato utilizzando organoidi derivati ​​da mutanti neonati con mortalità perinatale 6. Inoltre, la tecnica può essere applicata a organoidi derivate da topi knockout precedentemente stabiliti per studiare il ruolo di paralogues effettuando ulteriori 7,8 smontabile.

Dopo la creazione di piccole organoidi intestinali, adattamento del protocollo di cultura originale ha permesso coltura del pancreas, del fegato, del colon e dello stomaco epiteli 9-11. Inoltre, organoidi intestinali umani e organoidi tumorali sono stati derivati ​​da normali biopsie umane, primario adenoma e il cancro del colon-retto 10 biopsie. Il protocollo infezione virale può essere facilmente esteso a questi tipi di organoidi e fornisce un modo senza precedenti di eseguire studi funzionali nei tessuti di derivazione umana.

Nel loro insieme, trasduzione retrovirale di piccole organoidi intestinale è una risorsa preziosa per lo studio delle cellule staminali manutenzione, la differenziazione, e la decisione il destino delle cellule, così come le interazioni di segnalazione cellulare e la cellula cellulare.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Koo BK e Mustata RC sono supportati dal Sir Henry Dale Fellowship dal Wellcome Trust e Andersson-Rolf A è sostenuto dal Medical Research Council (MRC). Fink J è supportato dal dottorato di ricerca-programma di 4 anni Wellcome Trust.

Materials

Advanced DMEM/F12  Invitrogen 12634-034
Glutamax 100x  Invitrogen 35050-068
Hepes 1M  Invitrogen 15630-056
Penicillin- Streptomycin 100x Invitrogen 15140-122
B27 supplement 50x Invitrogen 17504-044
N2 supplement 100x  Invitrogen  17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM   Sigma-Aldrich A9165-5G
mouse EGF 500 µg/ml Invitrogen Biosource PMG8043
mouse Noggin 100 µg/ml   Peprotech 250-38
R-Spondin conditioned medium The conditioned media is generated  from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013
Wnt conditioned medium The conditioned media is generated  from L cells, for details see Sato and Clevers 2013
Nicotinamide 1 M Sigma N0636
Y-27632 10 µM Sigma Y0503-1MG
Polybrene 8 µg/ml) Sigma H9268-5G
Standard BD Matrigel matrix BD Biosciences 356231 Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 )
supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.
24 well plate Greiner Bio One 662960
48 well plate Greiner Bio One 677980
CHIR99021 Sigma A3734-1MG
Platinum- E cells Cell biolabs RV-102
Puromycin Invitrogen A1113802
Blasticidin Invitrogen A1113902
Polyethyleneimine (PEI) Polysciences 23966
opti-MEM Life Technologies 51985-034
TrypLE Invitrogen 12605-010
Parafilm Sigma P7793-1EA
4-OHT Sigma H7904
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Referências

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  2. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
  3. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature. 9, 81-83 (2012).
  5. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PloS one. 8, e76871 (2013).
  6. Mustata, R. C., et al. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo. EMBO reports. 12, 558-564 (2011).
  7. Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, 293-297 (2011).
  8. Koo, B. K., et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 488, 665-669 (2012).
  9. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).
  10. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  11. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).

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Organoid CultureLgr5-positive Stem CellsEgfNogginR-Spondin3D Epithelial StructuresIn VitroIn VivoRetroviral TransductionFunctional GeneticsGene OverexpressionGene KnockdownSmall Intestinal EpitheliumPhenotypic AnalysisOrganotypic Model SystemGene Function

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Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J. Vis. Exp. (90), e51765, doi:10.3791/51765 (2014).
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