Modelleme Astrositom Patogenez<em> İn Vitro</em> Ve<em> In Vivo</em> Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma
Summary
Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Abstract
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Introduction
Astrositomlar en sık görülen primer beyin tümörü glioblastoma (GBM), bir sınıf IV astrositom vardır, 12-15 ay 1,2 medyan sağkalım en yaygın ve agresif bir alt tiptir. Yaygın astrositomlar, özellikle GBM, istilası, tam cerrahi rezeksiyon engellemektedir adjuvan tedavilerin etkinliğini sınırlayan ve kaçınılmaz tedavi sonrası nüks 3 yol açar. De novo (birincil) GBM ile ya da kaçınılmaz (ikincil) GBM 4 ilerledikçe daha düşük grade astrositom ile ya başlangıçta başvururlar. GBM genomik heterojen ve üç damarlı sinyal yolları yönlendiren genler birbirini dışlayan ve co-ortaya çıkan mutasyonlar ile karakterizedir: G 1 / S (Rb) hücre döngüsü kontrol noktası, reseptör tirozin kinaz (RTK) ve TP53 5-7 yolaklarıyla. GBM GBM alt tipi Grip Grip Ağrilari olduğunu düşündürmektedir, beyin hücre tiplerinin farklı benzer sentezleme profillerine sahip dört alt tipinin genomik oluşmaktadırköken 6,8,9 kendi hücre tarafından etkilemiştir. Iyi astrositom modelleri astrositomdur patogenezi sırasında belirli hücre tiplerine mutasyonların belirli kombinasyonları rolünü tanımlamak için gereklidir. Daha verimli preklinik ilaç geliştirme için bu modelleri yararlanan hasta sonuçlarını geliştirmemize yardımcı olacaktır. Mevcut astrositom modeller, insan hücre hatları, hasta türetilmiş ksenograftları (PDX) genetik olarak tadil edilmiş normal insan astrositlerin nöral kök hücreleri (MGK) ve genetik olarak fareler (GEM) 10-14 kurulmuş bulunmaktadır. Kortikal astrositleri ve NSC – – floxed onkojenik alleles çeşitli kombinasyonlarını barındıran GEM hasat Biz primer beyin hücrelerini kullanan bir alternatif olmayan germ GEM (nGEM) modeli 15 geliştirmiştir. Amaç, fenotipik i preklinik ilaç gelişimi için in vitro ve in vivo olarak karakterize edilmiş ve potansiyel olarak yararlanılabilir genetik olarak tanımlanmış hücrelerin astrositom modellerini üretmek için olanmmune-kompetan farelerde azaltılmıştır.
Kurulan insan hücre çizgileri Bunlar düz ön teknik yaygın olarak mevcuttur. Astrositoma patogenezinde ve in vitro ve in vivo ilaç yanıtı en yaygın olarak kullanılan model, ve immün yetersiz farelerde 10,11,16-18, ortotopik Xenografting üzerine kinetik ve tümör oluşum nedenlerinin tanımlanmış . Onların dezavantajları sadece yüksek dereceli astrositom çalışma sınırlayıcı, düşük-dereceli astrositomlardan kurulan hücre hatları oluşturmak için yetersizlik içermektedir; Kalkış tanımlanmış bir hücre eksikliği; genellikle orijinal hasta numunesinden gelen belirgin bir şekilde farklıdır genomik profiller ile kompleks genomik anormalliklerin mevcudiyeti; ve duyarlılık serumdaki 11,17,19-22, seri kültürü sırasında fenotipik ve genotipik sürüklenme için. Kurulan insan GBM hücre hatlarında bireysel onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçları genellikle eluc engeller aslında mevcut anomalilerin sayıda kamufle edilebilirDoğrudan genotip-fenotip sonuçları idation.
PDX immün yetersiz farelerde veya bağışıklık yetersizliği olan farelerde 12,23 beyinlerine ortotopik enjeksiyondan önce tanımlandığı gibidir, serumsuz ortam içinde yapışkan olmayan küremsi olarak kültür yoluyla hastaya izole astrositom hücrelerinin deri altına geçişi elde edilmektedir. PDX daha doğru bir insan astrositomas genomik manzara eder, fakat bilinen insan hücre çizgilerine benzer, tek tek onkojenik mutasyonların fenotipik etkisinin genomik karmaşıklığı nedeniyle 19,24 maskelenebilir. Özellikle yeni tedavilere karşılık olarak, belirli onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçlarını tanımlamak için, bilinen insan hücre çizgileri veya PDX panelleri genellikle, genotip-fenotip bağlantıları ortaya genelleştirilebilirliğini gösterir ve hücre çizgisi özel etkilerin ihtimalini en aza indirmek için kullanılmaktadır. PDX doğru insan astrositomaların, inc histopatolojik izlerini recapitulate ikeninvazyon luding, bilinen insan hücre çizgilerinin ortotopik ksenogrefleri genelde 21,23,25 yok. Buna ek olarak, normal insan astrositler ve NSC in vitro ve in vivo olarak 13,14,26 astrositom tümörogenez modellemek için tanımlandığı onkojenik mutasyonu olan genetik olarak tasarlanmış edilmiştir. Bu hücreler, bilinen insan hücre çizgileri ve PDX genomik karmaşıklığı eksikliği ve doğru bir şekilde insan astrositoma histopatoloji özetlemek, fakat in vivo olarak bağışıklık eksikliği, kemirgenlerde yabancı-doku naklinde gerektirir. Tüm insan hücre modelleri immün-aracılı ksenogreft reddini önlemek için bağışıklık yetersizliği olan kemirgen ana gerektirdiğinden, bu modeller stroma hedefli ve immün-modülatör preklinik soruşturma sınırlayıcı, bir singenik sisteminin yerel tümör-stroma etkileşimleri özetlemek başarısız ve sağlam bir bağışıklık sistemi eksikliği 10,11 terapiler.
Onkojenik Muta önceden belirlenmiş kombinasyonları fenotipik sonuçları GEM izni incelenmesiin situ tümörigenezinde sırasında in vivo leri. -Çıkışlı şartsız GEM gelişimi boyunca bütün dokular içinde mutasyonlara sahip ise, koşullu GEM hücre tipine özgü promoterler 10,11,15,18 kullanımı yoluyla, özel hücre tipleri Cre-aracılı rekombinasyon sınırlayan mutasyonların hedefleme olanak onkojenik allelleri floxed var. Koşullu astrositom GEM sağlam bir beyin içinde 11 farklı hücre tiplerinde onkojenik mutasyonların işlevsel roller ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Koşullu GEM kullanılarak in situ gliom klinik öncesi programı 1) bir in vitro bir korelasyon eksikliği, kompleks genotipler ile, in situ tümör gelişiminde, 3) uzun gecikme farelerin büyük gruplarının bir üreten 2) zorluk içeren bir dizi faktöre ile sınırlıdır , 4) ve stokastik tümör ilerlemesi. In situ uygun bir tümör oluşumu in vitro bir model eksik olduğundan, in vitro ilaç testi ağırlık gerçekleştirilemezi'inci geleneksel koşullu GEM modelleri. Diğer kanserlerin tersine, astrositom şartlı gem modelleri nadiren tek onkogenik mutasyon 11 ile uyarılmaktadır. Böylece, karmaşık ıslah programları çoklu onkojenik mutasyonlar ile koşullu GEM oluşturmak için gereklidir. Yüksek dereceli astrositom ilerleme genellikle tekdüze olmayan, stokastik bir şekilde ortaya çıkar ve sonuçta karmaşık genomik manzaralar ve hızlı büyüme kinetiği 27 ile tümörlere yol açar Dahası, astrositom başlatma, bu modellerde uzun bir kuluçka döneminden sonra penetransı değişken oluşur, 28. Koşullu GEM modellerinde değişken Penetrans ve malign ilerlemesi stokastik doğası bireysel farenin preklinik ilaç araştırmaları yaptığını kayıt önce yüksek dereceli astrositomaların varlığını ve yerini belirlemek için radyografik görüntüleme ile taranmalıdır gerektirir. Birlikte ele alındığında, bu sınırlamalar pr için gerekli üretim ve koşullu GEM büyük kohortlarda test engeleclinical uyuşturucu testi.
Belirli bir nöral hücre tipleri üzerinde bulunan viral reseptörü (tva) ifade etmek üzere geliştirilen GEM enfekte etmek için kuş retroviral (RCAS) vektör kullanır RCAS-tva GEM sistemi,, geniş bir astrositoma tümörogenez 11 modellemek için kullanılmıştır. Koşullu GEM aksine, bu model sistem karmaşık yetiştirme programları için gerek olmaksızın, belirli hücre tiplerinde çoklu onkojenik mutasyonun ortaya çıkmasına olanak tanır. Bununla birlikte, değişken penetrans aktif viral entegrasyonu sağlamak için bölünen hücreler için ihtiyaç ve bunlar, konakçı genomu 29 içine transgenlerin rastgele yerleştirilmesi ile sınırlıdır.
Diğer model sistemler 15 sınırlamaları birçok üstesinden çünkü GEM hasat hücreleri kullanması Sigara germ GEM (nGEM) modelleri, giderek daha önemli hale gelmektedir. Astrositoma patogenezinde hücre tipinin ve birlikte görülen mutasyon başlatma rolü engellemek için zordurbu habis ilerleyişi sırasında belirsiz hücre tipinde yaygın genetik mutasyonlar birikmiş son aşama tümörlerinden türetilmiştir, çünkü maden insan GBM hücresi türleri veya PDX tesis kullanılarak. Buna karşılık, astrositomaların tüm sınıflarda spesifik saflaştırılmış beyin hücre tipleri 11,30 içindeki genetik mutasyonlar tanımlanmış indükleyerek nGEM kullanılarak modellenebilir. Bu nedenle, belirli genetik mutasyon ve hücresel ve moleküler fenotipe hücre tipinin etkisi in vitro ve in vivo olarak belirlenebilir. Kurulan insan GBM hücre çizgilerine benzer bir şekilde, başlangıç nGEM kullanılarak in vitro ilaç testleri aynı hücreleri kullanılarak, in vivo testler için ilaç öncelik için kullanılabilir. In vivo olarak tümör oluşumu daha sonra ortotopikal bağışıklık-kompetan singeneik litermatlarından 30 beyinlerine nGEM hücreleri allogeneik belirlenebilir. Bu ortotopik alograft modelleridir nedenle, sadece sitotoksik a in vivo testler izinnd terapileri hedefli, ancak immün-modülatör ve stroma hedefli tedaviler de. Son olarak, tümör başlaması ve ilerlemesi üzerinde mikro-rolü, aynı hücre tipinde aynı mutasyonları kullanılarak, nGEM konvansiyonel GEM modelleri arasında sonuçları karşılaştırarak belirlenebilir.
Biz ve diğerleri birincil hücreler kullanılarak astrositomdur nGEM geliştirdik – astrositleri, MGK, ya olgodendrosit öncü hücrelerini (OPC) – GEM 30-34 hasat. Astrositom nGEM geliştirilmesi arkasındaki mantık, potansiyel olarak, bağışıklık-kompetan hayvanlarda klinik öncesi in vitro ilaç testleri için ve in vivo kullanılabilecek belirli hücre tiplerinde onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçlarını belirlemek için bir model oluşturmak için olmuştur. Rb1 loxp / loxp veya TgGZT – Biz ifade fenotipik WT kortikal astrositleri ve non-Cre gelen MGK, floxed RB yolun bir>% 94 C57 / BL6 arka plan üzerinde muhafaza koşullu GEM hasat121 – çeşitli kombinasyonlarda 35-39 genleri – Nf1 LoxP / LoxP, Kras G12D, PTEN LoxP / loxp – ve RTK / RAS / PI3K- yolu floxed. Bu Cre rekombinazı kodlayan adenoviral vektörler kullanılarak in vitro genetik yeniden neden oldu. Kortikal astrosit hasat hücre tiplerinin bir karışımını içerdiği için, bu kültürlerde GFAP + kortikal astrositler zenginleştirmek için, bu tür TgGZT insan GFAP promotöründen 121 olarak Ad5GFAPCre vektörler veya baskın onkojenik transgenleri, ikinci. Bu in vitro ve in vivo olarak kortikal astrositler ve NSC fenotipik G1 / S sonuçlarını (Rb) için, MAPK ve PI3K yolu tanımlanmış mutasyonlar. MAPK ve PI3K yolu ile aktive olan G1 / S hatalı olarak taklit insan astrosit moleküler proneural GBM ve ortotopik enjeksiyonu üzerine, düzgün büyüme kinetikleri, kısa süreye göre önceden belirlenmiş bir konumda oluşan tümörler, ve histopatolojikinsan GBM 30 al işaretlerinden. In vivo tümör büyümesinin tedavisine boyuna izlenmesi 40 cevaben tedavi gruplarına ya da tümör büyümesinin kantitatif analiz normalizasyonu ile klinik öncesi bir ilaç test yardımcı olur. Biz, lusiferaz sentezleyen kortikal astrositler enjekte edilmiş farelerin uzunlamasına biyolüminesans görüntüleme ile tümör büyüme kinetiklerini belirlenmiştir. Bu nedenle, elde edilen koşullu GEM kortikal astrositler ve NSC astrositom ve ilişkili mutasyonların işlevsel sonuçları ve klinik öncesi bir ilaç gelişimi için olası bir model sisteminin tanımı için izlenebilir model sistem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritik adımlar, 2), 3) iyice hücreleri ayırmak, meninks kaldırmak için korpus kallosum altında doku almadan korteksi çıkarılması için uygun hasat ve kortikal astrositlerde kültürünü 1) sağlamak ve 4) GFAP zenginleştirmek için + astrositlerden salınmaktadır. Biz GAFP + astrositlere zenginleştirmek için yöntemler (GFAP promotör kontrolü altında (bir baskın dönüşen transgen bir Ad5GFAPCre vektörü veya kullanımı ile TgGZT 121) genetik re…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
Referências
- Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, 1-49 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
- Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
- . Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
- Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
- Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
- Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
- Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
- Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
- Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
- Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
- Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
- Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
- Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
- Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
- Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
- Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
- McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
- Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
- Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. v. a. n., Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
- Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
- Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
- Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
- Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
- Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
- Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).
