Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
Dopaminergen Neuronen weniger als 1% der gesamten Anzahl von Neuronen im Gehirn. Diese geringe Menge an Neuronen regelt wichtige Hirnfunktionen wie Motorsteuerung, Motivation und Arbeitsgedächtnis. Nigrostriatalen dopaminergen Neuronen selektiv degenerieren bei Parkinson-Krankheit (PD). Diese fortschreitende Verlust von Nervenzellen ist eindeutig mit den Motoren Symptome der Pathologie (Bradykinesie, Ruhetremor und Muskelstarre) assoziiert. Die wichtigsten Vertreter der dopaminergen Neuronen verantwortlich Degeneration ist noch unbekannt. Allerdings scheinen diese Neuronen extrem anfällig in unterschiedlichen Bedingungen zu sein. Primärkulturen stellen eine der wichtigsten Modelle Eigenschaften und Merkmale von dopaminergen Neuronen zu untersuchen. Diese Kulturen können auf verschiedene Stressmittel, die PD Pathologie imitieren und zu neuroprotektiven Verbindungen, um zu stoppen oder zu verlangsamen neuronale Degeneration vorgelegt werden. Die zahlreichen transgenen Mausmodellen der PD, die Gener habenergaben sich im letzten Jahrzehnt weiter erhöht das Interesse der Forscher für dopaminerge Neuronenkulturen. Hier konzentriert sich das Video-Protokoll auf den empfindlichen Dissektion der embryonalen Gehirn der Maus. Präzise Exzision der ventralen Mittelhirn ist entscheidend für die neuronalen Kulturen ausreichend reich an dopaminergen Zellen zu erhalten, um nachfolgende Studien zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann mit embryonalen transgenen Mäusen realisiert werden und ist für die Immunfluoreszenzfärbung, quantitative PCR, second messenger Quantifizierung oder zum neuronalen Tod / Überleben Beurteilung.
Introduction
Dopamin, eine der wesentlichen Neurotransmitter im Gehirn 1,2, wird hauptsächlich von dopaminergen Mittelhirn (DA) Neuronen freigesetzt. Die Mehrheit der DA Neuronen befinden sich in der ventralen Teil des Mittelhirns 2-6. Mesostriatal, mesolimbischen und mesocorticalen Wege 2,5: schematisch, Mittelhirn-Neuronen DA kann in drei anatomisch und funktionell verschiedene Projektionssysteme aufgeteilt werden. Der Weg wird in nigrostriatale Motorik beteiligt, die mesolimbischen Bahnen spielen eine wichtige Rolle in der Verstärkung, Motivation und Lernen, während die dopaminergen Bahnen zum präfrontalen Kortex vorstehen, sind in Erkenntnis 2 beteiligt.
DA-Neuronen in mehreren neurologischen Störungen menschlichen wie Schizophrenie, Aufmerksamkeitsdefizit, Hyperaktivität Erkrankung und Parkinson-Krankheit (PD) 2,4 beteiligt. PD wird durch eine progressive Degeneration der selektiven und DA Neuronen verbinden Substantia nigra gekennzeichnetpars compacta (SNC) zum Striatum. Der Verlust der nigrostriatalen DA Neuronen führt zu einer starken Verarmung Dopamin im Striatum, die verantwortlich für die motorischen Symptome der PD (Bradykinesie, Ruhetremor, und Steifigkeit) 7. Die ursprüngliche Ursache der idiopathischen PD ist nicht nachgewiesen und die aktuellen Behandlungen sind nur symptomatisch, mit dem Ziel der Wiederherstellung Dopaminspiegel im Striatum. Das verschriebene Medikament ist L-Dopa (Levodopa), das natürliche Vorläufer von Dopamin. Obwohl Verabreichung von Levodopa kompensiert den Verlust von Dopamin zu einer bestimmten Zeit auftreten Motor Komplikationen nach einer Langzeitbehandlung (Dyskinesie und / AUS-Zustände) 8,9.
Forschung auf dopaminerge Neuronen und PD ist in ständiger Progression und intensive Anstrengungen unternommen werden, um Behandlungen auf Zelltransplantation, Gentherapie, oder neuroprotektive Mittel 10,11 zu entwickeln. Allerdings bleibt ein wichtiges Thema nicht geklärt: Was ist die Ursache für die extreme vulnerability von DA Neuronen? Ein Teil der Antwort kann in der Aktivität von Neuronen DA gefunden werden. Eine Reduktion der elektrischen Aktivität und der Erregbarkeit von DA-Neuronen scheint die Neigung zu degenerieren 12 zu erhöhen. Dennoch ist die Komplexität der PD Pathogenese erfordert weitere Studien, um die Mechanismen in DA Neuronen beteiligt Degeneration 13-15 identifizieren.
Primärkulturen sind besonders relevant für die DA Neuron Eigenschaften 16-19 studieren und diese Neuronen auf verschiedene Belastungen für die Bewertung der neuroprotektive Mittel 20-24 herauszufordern. Ratte Kulturmodelle werden häufig verwendet, da die Präparation der Rattenembryohirn ist einfacher, verglichen mit der Maus, und höhere Mengen von Neuronen bei Ratten erhalten werden. Allerdings hat von transgenen Mausmodellen der Krankheit 25 deutlich erhöht das Interesse der Neurowissenschaftler Community für Primärkulturen von der Maus 26-29. Obwohl Kulturen prvon neugeborenen Tieren epared verwendet werden kann, ist es besser, sie von Embryonen im post-mitotischen Stadium (E13.5 für Mesencephalon-Neuronen) herzustellen, wenn Neuronen haben ihre Fähigkeit zur Differenzierung beibehalten. Das folgende Protokoll stellt isoliert Hirn-Neuronen in Primärkultur von Maus-Embryonen (E13.5), die am schwierigsten zu vorzubereiten. Insbesondere stellen wir ein Protokoll mit serumfreiem Kulturmedium für eine bessere Reproduzierbarkeit. Die beiden wichtigsten Schritte in der Kultur-Präparat (Dissektion und mechanische Dissoziation) wird vorsichtig in den zugehörigen Video detailliert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt die Verfahren und Reagenzien notwendig, eine Primärkultur von Mittelhirnneuronen von der embryonalen Maus und der Immunfluoreszenz-Verfahren zu dopaminergen Neuronen zu erkennen vorzubereiten. Kritische Schritte des Verfahrens sind die Dissektion der Embryonen und die mechanische Dissoziation der Fragmente gesammelt Gehirn. Hochwertige Dissektionsinstrumente hilft, die Technik zu beherrschen Dissektion. DA-Neuronen bilden einen kleinen Teil des Mittelhirns. Dementsprechend sammelt den rechten Te…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
Referências
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O’Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson’s disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson’s disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson’s disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson’s disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson’s disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neurociência. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
