Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
Muitas doenças relacionadas com o cérebro tem a morte celular neuronal envolvida na sua fisiopatologia. Melhoria em modelos in vitro para estudar os efeitos neuroprotetores ou neurotóxicos das drogas e vias a jusante envolvidos ajudaria a obter insights sobre os mecanismos moleculares de neuroproteção / neurotoxicidade e, potencialmente, poderia facilitar o desenvolvimento de drogas. No entanto, muitos ensaios in vitro de toxicidade existentes têm limitações importantes – mais avaliar a neurotoxicidade e neuroprotecção num único ponto de tempo, não permitindo observar o decurso do tempo e a cinética do efeito. Além disso, a oportunidade de coletar informações sobre as vias de sinalização a jusante envolvidos na neuroproteção em tempo real seria de grande importância. No protocolo corrente que descrevem a utilização de um analisador de células à base de impedância em tempo real para determinar os efeitos neuroprotectores da serotonina 2A (5-HT 2A) agonistas do receptor numa linha de células neuronais sob livre de marcador e em tempo real Conditíons, utilizando medidas de impedância. Além disso, demonstra-se que os inibidores das vias de segundo mensageiro podem ser utilizados para delinear as moléculas jusante envolvidos no efeito neuroprotector. Os requerentes também descrevem a utilidade desta técnica para determinar se um efeito sobre a proliferação celular, contribui para um efeito neuroprotector observada. O sistema utiliza placas de microeletrônica especiais referidas como E-placas que contêm alternando matrizes de microeletrodos de ouro na superfície inferior dos poços, que servem como sensores celulares. A leitura da impedância é modificada pelo número de células aderentes, a viabilidade celular, a morfologia e a adesão. Um parâmetro adimensional chamado Índice celular é derivada das medições de impedância eléctrica e é usado para representar o estado da célula. Em geral, o analisador de células à base de impedância em tempo real permite em tempo real, livre de marcador de avaliação de neuroprotecção e neurotoxicidade, e a avaliação do envolvimento das vias de segundo mensageiro, contribuindo para maisavaliação detalhada e de alto rendimento de potenciais compostos neuroprotetores em vitro, para a seleção de candidatos terapêuticos.
Introduction
Morte das células neuronais desempenha um papel fundamental na fisiopatologia de várias doenças relacionadas com o cérebro 1. A disponibilidade de dados fiáveis e de alto rendimento em ensaios de toxicidade in vitro é fundamental para obter uma melhor visão sobre os mecanismos de neurotoxicidade e ajudar a selecionar moléculas neuroprotetores como candidatos terapêuticas no desenvolvimento de medicamentos 2. No entanto, existem muitas limitações para mais amplamente utilizados em assays.They neurotoxicidade in vitro avaliar a neurotoxicidade / neuroprotecção a um único ponto de tempo, não permitindo resolução cinética; costumam usar etiqueta ou sonda que pode interferir com as vias de sinalização e limitar estudos adicionais na mesma população de células, e muitas vezes são de trabalho intensivo, e em muitos casos não fornecem uma visão mecanicista. No presente estudo demonstram a utilidade de um analisador de células à base de impedância em tempo real para determinar a neurotoxicidade e neuroprotecção em uma linha de células neuronais em tempo real e sob livre de marcadorcondições e fornecer informações sobre os mecanismos a jusante, através da análise das vias de segundos mensageiros envolvidos no efeito.
Estudos anteriores confirmaram a validade do analisador de células em tempo real para determinar a citotoxicidade, bem como os efeitos sobre a proliferação de células nas linhas de células em comparação com as técnicas convencionais 3,4,5,6. Por exemplo, observou-se uma boa correlação entre as leituras do ensaio padrão de viabilidade celular WST-1 e valores de índice de células em vários pontos de tempo, sob condições de proliferação basal e após dois paradigmas diferentes tóxicos em células HeLa 3. Em A549 e MDA-MB-231 células de proliferação e de citotoxicidade provocada com o paclitaxel microtúbulos estabilizador mostrou valores muito semelhantes, quando avaliada através de medições de índice celular e utilizado de forma padrão a sulforodamina B (SRB) 4. Na linha de célula neuronal de neurônios do hipocampo imortalizados HT-22 Celulares medições do Índice foram validados por sua capacidade to detectar a proliferação de células, a citotoxicidade do glutamato e citoprotecção contra a amplamente utilizado 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil-brometo (MTT) 5. No mesmo estudo os resultados do ensaio de MTT e medições de índice celular também se correlacionou bem na medição neuronal proliferação de células progenitoras, citotoxicidade após privação de fatores de crescimento e resgate de citotoxicidade pelo pan-caspase inibidor QVD 5. A citotoxicidade induzida em células NIH 3T3 por Vandetanib (crescimento endotelial vascular receptor do factor inibidor e do receptor do factor de crescimento epidérmico), mostrou resultados semelhantes medidos com os valores de índice celular ou ensaio de incorporação de vermelho neutro 6.
Usámos recentemente o sistema analisador de células em tempo real para avaliar os efeitos neuroprotectores da serotonina 2A (5-HT 2A) agonista do receptor de cloridrato de (±) -2,5-dimetoxi-4-iodoamphetamine (DOI), em uma linha de células neuronais ( células SK-N-SH) e selecionados para o envolvimento de secoª vias Messenger através monitorar o efeito da sua inibição química sobre a neuroproteção observada 7. Curiosamente, o receptor 5-HT 2A tem agonistas tanto alucinógenas e nonhallucinogenic (como o DOI e lisuride, respectivamente), o que pode ativar ambas as segundas vias comuns de mensagem e distintas 8.
As vantagens da técnica apresentada é que ela permite a coleta de informações em tempo real sobre a sobrevivência das células no decorrer do dia, para delinear as vias de segundo mensageiro envolvido, para avaliar a possível contribuição de efeitos de proliferação de neuroproteção, e para selecionar um tempo ideal para estudos adicionais de ponto final sobre a mesma população de células. Um diagrama esquemático do fluxo no protocolo actual é apresentado na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo atual apresenta a utilidade de um analisador de células em tempo real para avaliar de forma contínua e em condições livres de etiqueta os efeitos neuroprotetores / neurotóxicos de compostos em linhas de células neuronais e para obter insights sobre as segundas vias mensageiros envolvidos no efeito.
Embora a utilidade do analisador de células em tempo real para estudar a toxicidade e efeitos das drogas sobre a proliferação celular é geralmente reconhecido, poucos estudos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
Referências
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