Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Mange hjerne-relaterte lidelser har neuronal celledød er involvert i deres patofysiologi. Forbedret in vitro modeller for å studere nervecellene eller nevrotoksiske effekter av narkotika og nedstrøms trasé involvert ville bidra til å få innsikt i de molekylære mekanismene for neurobeskyttelse / nevrotoksisitet og kan potensielt lette narkotika utvikling. Men mange eksisterende in vitro toksisitetsanalyser har store begrensninger – mest vurdere nevrotoksisitet og neurobeskyttelse hos en enkelt tidspunkt, ikke tillater å observere den tid-kurs og kinetikken av den virkning. Videre vil muligheten til å samle inn informasjon om nedstrøms signalveier involvert i nevro i sanntid være av stor betydning. I den nåværende protokoll beskriver vi bruken av en sanntids-impedans-baserte celle analysator for å bestemme nevrobeskyttende effekter av serotonin 2A (5-HT 2A) reseptoragonister i en neuronal cellelinje i henhold til etikett-fri og sanntids conditioner ved hjelp impedansmålinger. Videre viser vi at inhibitorer av andre messenger-veier kan brukes for å avgrense nedstrøms molekyler som er involvert i nevrobeskyttende virkning. Vi beskriver også anvendelsen av denne teknikken for å bestemme om en effekt på celleproliferasjon bidrar til en observert neurobeskyttende effekt. Systemet benytter spesielle mikroelektroniske platene referert til som e-platene som inneholder alternerende gull microelectrode matriser på den nederste overflaten av brønnene, som tjener som cellefølere. Impedansen avlesning er modifisert ved antallet adherente celler, celle-levedyktighet, morfologi og adhesjon. En dimensjonsløs parameter som kalles celleindeks er avledet fra de elektriske impedansmålinger, og blir brukt til å representere den celletilstand. Samlet sett gir sanntids impedans-baserte celle analysator for real-time, etikett-fri vurdering av nevro og nevrotoksisitet, og evaluering av andre messenger trasé engasjement, bidrar til merdetaljert og high-throughput vurdering av potensielle nevrobeskyttende forbindelser in vitro, for valg av terapeutiske kandidater.
Nevronal celledød spiller en avgjørende rolle i patofysiologien av mange hjernerelaterte lidelser en. Tilgjengeligheten av pålitelig og høy gjennomstrømming in vitro toksisitets analysene er avgjørende for å få bedre innsikt i mekanismene for nevrotoksisitet og bidra til å velge nervecellene molekyler som terapeutisk kandidater i legemiddelutvikling to. Det er imidlertid mange begrensninger til de mest brukte in vitro nevrotoksisitet assays.They vurdere neurotoksisitet / neurobeskyttelse hos en enkelt tidspunkts ikke tillater kinetiske oppløsning; bruker ofte etikett eller sonde som kan forstyrre signalveier og begrense ytterligere studier i samme cellepopulasjon, og er ofte arbeidskrevende, og i mange tilfeller ikke gir mekanistisk innsikt. I den foreliggende undersøkelse viser at det er nytten av en sanntids-impedans-baserte celle analysator for å bestemme neurotoksisitet og nevrobeskyttelse i en neuronal cellelinje i sanntid og under etiketten frittforhold og for å gi innsikt i nedstrøms mekanismer gjennom analyse av andre messenger-veier som er involvert i virkningen.
Tidligere studier har bekreftet gyldigheten av sanntids-celle analysator for å bestemme cytotoksisitet samt virkninger på celleformering i cellelinjer i sammenligning med standardteknikker 3,4,5,6. For eksempel ble en god korrelasjon observert mellom avlesninger av standard celle levedyktighet WST-1-analysen og celleindeksverdier på flere tidspunkter i henhold basal spredningsforhold og etter to forskjellige giftige paradigmer i HeLa celler tre. I A549 og MDA-MB-231 celler spredning og cytotoksisitet provosert med microtubuli stabilisator paclitaxel viste svært like verdier når vurdert av Cell Index målinger og standardly brukt sulforhodamine B (SRB) assay fire. I nevronale cellelinje av udødeliggjort hippocampus nevroner HT-22 Cell Index målinger ble validert for sin evne to detektere celleproliferasjon, glutamat cytotoksisitet og cytoprotection mot den mye brukte 3-(4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium-bromid (MTT) assay 5. I den samme studien MTT analyseresultatene og Cell Index målinger også korrelert godt i måling nevronale stamceller spredning, cytotoksisitet etter vekstfaktorer deprivasjon og redning av cytotoksisitet av pan-caspase inhibitor Qvd fem. Cytotoksisitet indusert i NIH 3T3-celler ved Vandetanib (vaskulær endotelial vekstfaktor-reseptor, og epidermal vekstfaktor-reseptor-inhibitor), viste tilsvarende resultater målt med Cell indeksverdier eller nøytral-rød opptaksanalyse 6..
Vi har nylig benyttet sanntidscelleanalysesystemet for å vurdere nevrobeskyttende effekter av serotonin 2A (5-HT 2A) reseptoragonist (±) -2,5-dimetoksy-4-iodoamphetamine hydroklorid (DOI) i en neuronal cellelinje ( SK-N-SH-celler) og skjermet for involvering av second messenger-veier gjennom overvåke effekten av deres kjemiske hemming på den observerte neurobeskyttelse 7.. Interessant nok har 5-HT 2A reseptor både hallusinogene og nonhallucinogenic agonister (som DOI og lisurid, henholdsvis), som kan aktivere både felles og distinkte andre messenger trasé åtte.
Fordelene med den fremlagte teknikk er at det gjør det mulig å samle informasjon i sanntid om celleoverlevelse i løpet av dager, for å avgrense andre messenger-veier som er involvert, for å vurdere den mulige bidrag av spredningseffekter til nevrobeskyttelse, og for å velge en optimal tids for ytterligere end-point-studier på den samme cellepopulasjon. Et skjematisk diagram av arbeidsflyten i den aktuelle protokoll er presentert i figur 1.
Den nåværende protokollen presenterer nytten av en real-time celle analysator til kontinuerlig å vurdere og under merkefrie forhold de nervecellene / nevrotoksiske effekter av forbindelser i nevronale cellelinjer og å få innsikt i de andre messenger trasé involvert i effekt.
Selv om sanntids celle analysator verktøyet for å studere cytotoksisitet og effekten av medikamenter på celleproliferasjon er generelt anerkjent, har bare noen få studier anvendes den i neuronale relaterte cell…
The authors have nothing to disclose.
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
(±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |