Latexagglutination testning är en enkel, snabb och billig metod för serotypning Streptococcus pneumoniae, och har också i stor utsträckning i diagnostisk mikrobiologi. Detta manuskript beskriver intern produktion av latexagglutination reagenser, rutiner för kvalitetskontroll och tillämpningen av denna teknik för att pneumokocker serotypning.
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Streptococcus pneumoniae (pneumokocker) är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet hos barn under fem år i hela världen, särskilt i resurssvaga miljöer 1,2. Intervall pneumokocksjukdom från lokala infektioner till livshotande tillstånd som lunginflammation, blodförgiftning och hjärnhinneinflammation 1,2.
Mer än 90 serotyper av pneumokocker har identifierats utifrån skillnader i deras kapselpolysackarid 3. Aktuella vacciner rikta kapselpolysackariden och ge skydd mot de stora serotyper som orsakar invasiv sjukdom 4. Serotypning pneumokocker isolat är viktig för att bedöma effekterna av vaccination på vagnen och sjukdom samt att ge mer omfattande epidemiologiska uppgifter 5,6. Den nuvarande "gyllene standarden" metod för pneumokocker serotypning är Quellung testet, men det är tidskrävande och kräver en del skicklighet för att perform 7. Latexagglutination är en alternativ serotypning metod som rekommenderas av Världshälsoorganisationen 7. Latexagglutination är snabb och enkel att utföra, och används i många laboratorier världen över 8-11. Viktigt har latexagglutination visat jämförbar noggrannhet till Quellung testet för pneumokocker serotypning 10,12-14. Totalt sett är denna metod idealisk för resurssvaga miljöer samt hög genomströmning laboratorier.
Latexagglutination reagenser ('latex reagens ") skapas genom att fästa antikroppar till latexpartiklar 15. I en positiv reaktion, dessa märkta partiklar agglutinerar i närvaro av specifikt antigen. Kommersiella latexreagens är tillgängliga för ett begränsat sortiment av serotyper. Latex reagens kan också beredas internt med hjälp av kommersiellt tillgängliga antisera 10. Blandningar av antiserum ("pooler") samt specifika antisera för pneumokock-serogroups (t.ex. grupp 19), enskilda serotyper (t.ex. serotyp 5), och till specifika antigener ("faktorer", till exempel., faktor 19c erkänner serotyp 19A) för ytterligare definiera serotyper inom grupper är tillgängliga 16.
Detta manuskript beskriver de viktigaste stegen i produktionen av latexreagens som använder passiv fastsättning av kommersiellt tillgängliga antisera till latexpartiklar. De kvalitetskontroll (QC) aspekter av denna metod beskrivs, och ett protokoll för användning av latexreagens för pneumokocker serotypning ingår.
Latex agglutinationen är en enkel, snabb och billig metod för pneumococcal serotypning. Kommersiella pneumokock latexagglutination reagenser finns, men de för närvarande inte skilja alla kända serotyper av pneumokocker 10,12. Däremot kan latexagglutination reagenser lätt produceras i egen regi med hjälp köpt antisera mot specifika pneumokocker kapselantigener. I den här beskrivna metoden, är antikroppar passivt fäst vid latexpartiklar för att göra en uppsättning av latexagglutination reagens.
En positiv latex reaktion sker när specifika antikroppar bundna till latexpartiklarna fäster antigener på polysackaridkapsel av pneumokocker isolera 18,19. De latexpartiklar bundna till antikropparna tillåta specifik antikropp-antigenreaktion som skall visualiseras utan förstoring.
Latexagglutination är en lämplig metod för hög genomströmning laboratorier ettd även för resurssvaga miljöer. Viktiga fördelar med latexagglutination metoden är att ingen specialutrustning som krävs för att utföra provet, reagens har en hållbarhet på minst 2 år vid förvaring vid 4 ° C 8, och att det är billigt, enkelt och snabbt att utföra. Serotypning ett pneumokock isolat från latexagglutination tar ca 10 min och upp till fyra latexreagens kan testas parallellt på en bild. Dessutom, om prevalensen av serotyper är känd för den aktuella epidemiologiska inställning, testning kan utföras i omgångar börjar med poolerna innehåller de vanligaste serotyperna i likhet med Quellung testet 17. Detta tillvägagångssätt minimerar antalet tester som behövs för att bestämma serotyp. Metoden är också mycket reproducerbar mellan olika operatörer (data ej visade). En nackdel med latexagglutinering serotypning är att framställa reagensen är tidskrävande, tar ca 4 h; även om multipla Reagents kan lätt framställas parallellt. Dessutom kan vissa antigener är vanliga i olika pneumokockserotyper, vilket resulterar i korsreaktioner med vissa antisera (t.ex. serotyp 29, 42 och grupp 35). Men dessa korsreaktioner väl karakteriserade vid användning av kommersiella antisera (som vanligtvis är förabsorberats att ta bort de mer problematiska korsreagerande antikroppar) och ytterligare reaktions tabeller som tillhandahålls av tillverkaren för att särskilja vilken serotyp är närvarande. Latex reagens kan också korsar reagera om antikropparna inte är ordentligt justerade på latexpartiklarna; dessa detekteras som QC misslyckanden. Enligt vår erfarenhet är rigorös QC central för att lyckas med denna metod, även om kommersiellt tillgängliga antisera används för produktion. QC tar ca 15 min per reagens och förlitar sig på en uppsättning lämpliga QC isolat som beskrivs ovan.
Den metod som beskrivs här resulterar i reagenser som ger en positiv reaktion väl witunna testperioden. Enligt vår erfarenhet, falska positiva är sällsynta i praktiken (data ej visade). Enstaka falskt negativa reaktioner iakttas; oftast dessa hänför sig till kända problem med en viss antiserum (t.ex. kan serogrupp 6 isolat inte reagerar med pool B antiserum) eller nedreglering av kapseluttryck av isolat. Använda serotypning algrorithm från tillverkaren är också viktigt, som i de flesta fall en falsk positiv eller negativ reaktion kommer att leda till en "blinda änden" resultat. I dessa fall, och när reaktioner är svåra att tolka, rekommenderar vi upprepa-testning och / eller testning av en alternativ metod, såsom den Quellung reaktionen.
Viss felsökning ibland krävs för att göra tillfredsställande latexreagens. I den här beskrivna metoden är antikroppen bunden till latexpartiklar via passiv adsorption 15,19, så en kritisk variabel är koncentrationen av antikropp som används, vilket avgör hur välytan av latexpartiklarna är täckt och den efterföljande inriktning av de antikropps aktiva ställen 15,20. Om följaktligen otillräcklig eller överskott av antikropp är bunden till latexpartiklarna, de antikropp-antigen-reaktioner kommer inte att vara optimal, och otillfredsställande reagens kan framställas 15,20,21. Som antikroppstitrar varierar mellan olika massor av antisera kan en standarduppsättning av späd producerar inte reagenser som ligger långt 8. En bra utgångspunkt är att använda en 1:40 spädning av antiserum, och om detta inte lyckas, späd antiserum ytterligare. Enligt vår erfarenhet är detta löser oftast problemet 8. I ett litet antal fall reagens kan visa svag agglutination som inte åtföljs av clearing av suspensionen vid test med målet isolat. I dessa fall utspädning av antiserum inte förbättra kvaliteten på reagenset, men tillfredsställande reagens kan vanligen framställas genom att utelämna centrifugering och tvättsteg 8,22 </sup>.
Antikroppsbelagda latexpartiklar används vanligen inom mikrobiologisk diagnostik för detektion, identifiering eller serotypning av många olika mikrober 15,20. Som sådan kan den här beskrivna metoden vara lämplig för framställning av latexreagens för andra ändamål, tillhandahålls lämplig antisera tillgängliga och lämpliga kvalitetskontrollförfaranden antas.
The authors have nothing to disclose.
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
Glycine | Merck | 10119.05 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
*alternative sources are available for most materials |