リプログラマブルマウスモデルからのiPS細胞の中間体の精製を媒介細胞表面マーカー

1 [機器の設定/試薬の調製/ジェノ iPS細胞培地の調製：5台の白血病抑制因子を75mlで500ミリリットルノックアウトDMEM培地サプリメントウシ胎児血清（FBS）を5mlのL-グルタミン5mlの非必須アミノ酸、500μlのβ-メルカプトエタノール、5×10（ LIF）。この原稿の文脈で使用される試薬の製品や購入については、物質一覧をご参照ください。 MEF培地を準備し、50ミリリットルのFBS、5ミリリットルのL-グルタミン、5ミリリットル非必須アミノ酸と5ミリリットルピルビン酸ナトリウム、500μlのβ-メルカプトエタノールを500ミリリットルDMEM培地サプリメント。 凍結培地の準備：10ミリリットルのために、1mlのDMSOとFBSの9ミリリットルを兼ね備えています。 右の使用の前に少なくとも10分間吸引をRTでインキュベート、ゼラチンコーティングされた料理はT75フラスコに3〜5ミリリットルの0.1％ブタゼラチン溶液を添加調製します。 FACSの標識培地を準備します。10ミリリットルのために、FBSの0.1ミリリットルを含むPBSの9.9ミリリットルを兼ね備えています。 実行するRosa26遺伝子m2rtTA遺伝子座について遺伝子型決定PCR：製造業者の説明書に従って、DNAポリメラーゼとの反応を実行します。 oIMR8052：5 'GCG AAG AGT TTG TCC、TCA、ACC 3'、oIMR8545：5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 '、oIMR8546：5' GGA GCG修正された3.5 mmで、以下の3のプライマーのMgCl 2 -concentrationを使用してくださいGGA、GAA ATG GAT ATG 3 '。サイクリング条件：3分94℃; （30秒94℃、1分間65°C、1分間72℃）の35サイクル; 2分間72°C; 12℃で保持します。予想製品サイズ：野生型対立遺伝子650 bpおよび変異対立遺伝子340塩基対。 コラーゲンStemCa / OKSMの座について遺伝子型決定、PCRを実行します。指示に従って、DNAポリメラーゼの反応を実行します。使用のMgCl 2を2.5mM、以下の3プライマーの-concentration更新日：COL / FRT-B：5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3'、COL / frtA1：5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3'、COL / frtC1：5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '。サイクリング条件：1分間95℃（30秒、45秒、70℃、94℃）の2サイクル、30サイクル（30秒、45秒、68℃で94℃）の6サイクル（20秒94℃、60℃、1分間）の; 5分間72°C; 12℃で保持します。予想製品サイズ：野生型対立遺伝子のための331 bpおよび変異対立遺伝子のための551 bpの。 4℃で3分間400×gですべての遠心操作を行ってください。 マウス胚線維芽細胞の2世代 m2rtTA株の反対の性別のメンバーとOKSM株の動物間の時限交配を行います。母親をカリングし、子宮角を除去することにより、胎生13.5で収穫の胚。子宮角を除去する前に、微生物汚染を回避するために、80％エタノール溶液で腹部スプレー。 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBを10 mlを含む10cmの組織培養皿に子宮角を転送するS）。 （ 図3A、Bを参照）1胚を含む断片に子宮角をカットする滅菌外科グレードのハサミを使用してください。 慎重に子宮エンベロープと各胚を取り巻く胚体外膜を除去するために解剖顕微鏡（理想的には、組織培養フード内に配置された）、滅菌ピンセットを使用してください。 10mlのPBSで独立した10cmディッシュに各胚を転送します。 胚の頭、手足、尻尾やピンセットで内臓（心臓、肝臓、腸など ） を除去することによって進みます（ 図3Cを参照）。 1.5mlチューブに胚の頭部を転送し、必要に応じて、それが遺伝子型決定のために使用することができるので、ダウンフリーズ。 空の10センチメートルプレートに胚の胴体を移し、2分間胚をミンチする2外科のブレードを使用しています。ミンチ胚の上にトリプシン/ EDTA溶液200μlを加え、室温で3〜5分間インキュベートする。さらに2分間のミンチを続け、中にMEF培地の2ミリリットルを追加トリプシンを活性化し、次いで15 mlのチューブに移す。 さらに機械的に穏やかにピペッティングすることによって組織を解離千μlのピペットを使用してください。ゼラチンコート10cmディッシュに移し、MEF培地の追加の10ミリリットルを追加します。注：両方の正常酸素および低酸素インキュベーターは培養に使用することができ、詳細については説明を参照してください。 24〜48時間後、プレートを密にしたMEFで覆われている必要があります。 あるいは、細胞は、その後さらに増殖またはダウン凍結することができる。細胞の凍結のために、培養培地を除去し、3ミリリットルのトリプシン/ EDTA溶液を用いてメディアやオーバーレイの痕跡を除去するために10ミリリットルのPBSで皿をすすぐ。 37℃で3〜5分間インキュベートする1​​5mlの遠心分離チューブにMEFメディア転送を5ml加えることによってトリプシン消化を不活性化する。スピンダウンし、メディアの凍結3mlにペレットを再懸濁します。 3クライオバイアルに移し、細胞凍結容器内にダウンして凍結する。 MEFは3。リプログラミングove_content ">注記：4℃で5分間、200×gでの遠心分離により細胞をペレット化し、再プログラミングのために正常酸素組織培養インキュベーターを使用することが低酸素条件下でのMEFを導出し、展開することが有益であることができる（5％酸素、詳細については説明を参照してください。 ）。 迅速水浴（37℃）で低継代クライオバイアル（P0-P1、2-3ミオ細胞）を解凍し、予め温めておいたMEF培地10mlのチューブに内容物を移す。ペレット細胞は、12ミリリットルの新鮮MEF培地中で再懸濁は、ゼラチンコートT75培養容器に移すと、細胞は先に進む前に24〜48時間で回復することができます。注：MEFにも直接導出して用いることができる。 培養培地を除去した後、トリプシン/ EDTA溶液（37℃で3〜5分間、3ml）で重ねることによってPBSとcellularizeでのMEFを洗う。 MEF培地を5mlを添加することによりトリプシンをクエンチし、さらに10 mlピペットで穏やかに混合することによって細胞を解離する。血球計数器を用いて細胞数を決定します。 reprogra用mming実験、6.7×10 3細胞/ cm 2の密度でゼラチンコートT75フラスコ上にシードのMEF（〜フラスコあたり0.5澪細胞）2μg/ mlのドキシサイクリンを含むIPSC媒体中。各時点での約2澪書き換え中間体を得るために、播種の勧告について、表1を参照してください。注：再プログラミングがドキシサイクリン（2μg/ ml）をを添加して開始されるメディアを補足し最初の6日間、新鮮なドキシサイクリンを補足IPSCメディア（T75フラスコあたりのメディアの12ミリリットル）で一日おきにメディアを交換。高い細胞数がある場合は、この点を超えると、日常的にメディアを更新する。メディアの変更のみ隔日に行うことができれば培養液量を倍増。 必要な時間点で収穫書き換え中間体：のために（3 mlでPBS適切な体積（T75フラスコのため10ml）でリンスし、トリプシン-EDTA溶液でオーバーレイし、培地を除去することにより（提案日3、6、9、12） T75フラスコ）。培養する37°Cで3〜5分間、穏やかにピペッティングに続いIPSC培地を5ml加えることによりクエンチした。 血球計数器で細胞懸濁液を数える（上記参照）、遠心分離によってペレット、トリプシンの痕跡を除去するために10mlのPBSで上清再懸濁細胞を吸引除去する。再び細胞をペレット吸引上清および再プログラミング中間体を単離するためにステップ4.1に進みます。注：再プログラミングを受けている細胞は、凍結保存され、後の段階で、FACS分離のために解凍することができます。 完全に再プログラムされたiPS文化を確立するために、さらに4-7日間のdoxフリーIPSC培地中で細胞を増殖させる。注：正常に再プログラムする文化が一日12によるコロニーが多数含まれています（ 図4を参照）。この間、まだOKSM発現を必要と異常なiPS細胞が消えます。 代わりに、残りの完全に再プログラムされたiPS文化を伝播するために：最初は、15×10 3細胞/ cm 2の密度で照射されたMEFをシード</s>アップT75コーティングされたゼラチンの上にIPSCメディア12mlに1日以上前の実験と6時間後にフラスコ。 次に、培地を除去し、PBS 10mlでT75フラスコをすすぎ、トリプシン-EDTA溶液3mlでオーバーレイし、37℃で3〜5分間インキュベートすることによりcellularize iPS細胞培養物。 、穏やかに混合しIPSCメディアの5ミリリットルを添加することにより、トリプシンをクエンチ15ミリリットルコニカルチューブに移し、スピンダウンした後、10ミリリットルのiPS培地に再懸濁。 照射したMEF（T75フラスコ）にこの細胞懸濁液を500μlを移し、培養物は4〜5日間成長させる。注：樹立されたiPS培養物は、凍結保存または実験のために使用することができる。クローン細胞株は、解剖顕微鏡の下で22の個別IPSCコロニーをピッキングすることによって導出することができる。 MEFは2.8で説明したようにクライオコンフルエントIPSC文化を保持します。 4。抗体標識で、第3節で調製した再プログラミング培養物の再懸濁細胞ペレット、抗体を補充し、FACSラベリングメディア（1抗Thy-1.2パシフィックブルー：400、抗SSEA-1ビオチン1：400および抗EpCAM FITC 1：400）。 500万細胞あたりを補足標識ミックスを200μlを使用し、氷上でインキュベートする。 10分後、穏やかに細胞を再懸濁し、氷上でさらに10分間インキュベートし、チューブをタップします。チューブあたりの冷PBS 10ミリリットルを加え、スピンダウン。 500万細胞あたり：各チューブについて（200 1）1μlのストレプトアビジンPeCy7補充したラベルメディア200μlの準備に染色する。細胞がペレット化したら、慎重にストレプトアビジンPeCy7補充したラベリングメディアの適切な容量の上清と再懸濁を吸引。 、再懸濁、氷上でさらに10分間インキュベート、チューブあたりの冷PBSを10mlを追加し、スピンダウンし、上清を吸引除去しをタップ、10分間氷上で細胞を保管してください。 約1×10 7細胞/ mlのヨウ化プロピジウム（PI）（2μg/ ml）を補充した、標識培地中で再懸濁し、細胞ペレット。 70μmのストレーナーにサスペンションを通過させることによって、細胞塊を除去します。適切なFACSチューブに細胞を移し、氷上に保管してください。 個別の抗体（抗Thy-1.2、抗SSEA-1および抗EpCAM）付きの独立したサンプルを準備します。注：これらの分析に使用される三つのチャネルにおける色補正を行うために必要とされる。さらに、非標識細胞ソーティングのための電圧およびゲートを設定するために必要とされる。理想的には、iPS細胞は、補償のために使用されます。、照射MEF上に維持さ0.5〜1×10 6 iPS細胞のストックを、液体窒素中で凍結バイアルに保存されます。 MEFはの存在は汝-1.2チャンネルの信号を得ることが不可欠である。 MEFは（セクション3）について記載したようにiPS細胞のクライ​​オバイアルを解凍する。遠心分離後、標識バッファー800μlのこのサンプルの200μl中に再懸濁細胞を、標識されていないコントロールとして確保されている。 補償コントロールとして残りの細胞を使用してください。 3 15ミリリットルチューブ間のセルを分割し、抗体を追加次のように：パシフィックブルー補償制御を：抗Thy-1.2パシフィックブルー抗体の0.5μlを添加する。 FITC補償管：抗EpCAM-FITC抗体の0.5μlを添加する。 PE-Cy7の補償制御：抗SSEA-1-ビオチン抗体0.5μlの。 、氷上で10分間細胞 – 抗体のサンプルをキープタップして混合し、氷上で10分間インキュベートする。 10ミリリットルの冷PBSで洗浄サンプルは、未結合の抗体を除去し、細胞をスピンダウンし、上清を吸引する。 FACSラベリングメディア200μlの再懸濁細胞ペレット。 抗SSEA-1-ビオチン標識された試料については、ストレプトアビジンPeCy7コンジュゲート（200μlの細胞あたり1μl）を追加します。一次抗体（SSEA-1-ビオチン）について記載したラベル細胞。 70μmのストレーナーに標識されていないコントロールを含むすべてのサンプルをパスし、PI（2μg/ mlの）を追加します。 FACSチューブに細胞を移し、必要になるまで氷上に保つ。 中間体の5 FACS単離注：細胞を405nm、488 nmおよび560 nmの励起レーザーおよび100μmのノズルを蛍光活性化セルソーターを使用して並べ替えられています。 細胞集団が適切に可視化されるように、前方および側方散乱のための電圧を設定する。破片を排除するために、図5Aに示されるように、セルの周囲にゲートを描画します。注：セルソーターの電圧の正しいセットアップが複雑で、経験豊富なFACSオペレータを必要とすることができます。 FSC面積に対する利用前方散乱（FSC）高さは、骨材（ 図5B）を除外します。 PI陰性の生細胞（ 図5C）上におけるゲートへのFSCに対するPIチャネルを可視化。 PB、FITC / GFP、PE-Cy7での蛍光のチャネルの電圧を調整するために非標識細胞を使用してください。理想的には、それぞれのチャネルの下端に細胞集団を配置。 リプログラミングカルトサブ画分に図6A、Bに示すように、非標識コントロール細胞とゲートを設定します3日目、6にURESと9集団：SSEA-1〜/のThy-1.2 +細胞; SSEA-1〜/汝-1.2-細胞;そして再プログラミングは、SSEA-1 + /のThy-1.2〜細胞を仲介。 さらにFITCブロットに対するPE-Cy7のを使用して9日目SSEA-1 + /のThy-1.2〜分数を分割。 SSeが-A1 + /のEpCAM +細胞およびSSEA-1 + / Epcam-細胞の周りにゲートを描きます。 図6C、Dに示すように、非標識コントロール細胞とゲートを設定します。 iPS細胞培地（1-2）で洗浄したプレフィル適切な採血管希望亜集団をソートする前に（9/12日の文化やiPS細胞6 /日3日目/日、のMEFのための代表的なFACSプロファイルについては、図7を参照）。 FACSソーティングプロトコールを製造しているに応じて実行します。 FACS分離した後、分子プロファイリング（RNA /タンパク質抽出、クロマチン免疫沈降法は、DNA methylome解析など）にセルを送信してください。あるいは、さまざまな細胞画分を培養することができる。