Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

1 Seqüência de Projeto e Síntese Comece MPRA com o desenho e síntese de sequências a ser testado para a actividade reguladora. Para compatibilidade com a série vector pMPRA, projetar cada seqüência usando o seguinte modelo: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 ', onde var denota a seqüência a ser analisada e tag denota uma ou mais marcas de identificação. As duas regiões variáveis ​​(e var tag) são separados por um par de Kpnl (GGTACC) e XbaI (TCTAGA) locais de restrição para facilitar a ligação direccional de um fragmento do gene repórter entre eles. Além disso, dois locais distintos Sfil (GGCCNNNNNGGCC) será adicionado por PCR para permitir a ligação direccional no esqueleto pMPRA. As regiões variáveis ​​não devem conter cópias adicionais de qualquer destes locais de restrição. Se necessário, uma ou mais destas enzimas de restrição pode ser substituído, Desde que as substituições 1) permitir que o corte eficaz perto das extremidades de moléculas de DNA, e 2) não cortar em outros lugares na sequência do vector. Veja a discussão para obter detalhes adicionais. Obter os iniciadores necessários listados na Tabela 1 a partir de um fornecedor comercial. MPRA_SfiI_F GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG MPRA_SfiI_R GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC TAGseq_P1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGseq_P2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [índice] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG Tabela 1 sequências de primer. [Índice] denota uma seqüência de índice 6-8 nt utilizado para seqüenciamento multiplexado. Obter pelo menos 8 primers TagSeq-P2 com diferentes índices. Todosdos iniciadores deve ser purificado por HPLC ou PAGE. Bibliotecas oligonucleotídicas podem ser obtidas a partir de um vendedor ou de núcleo instalação comercial, ou gerado usando um sintetizador de oligonucleótidos baseada microarray programável, tal como descrito pelo fabricante. Ressuspender os produtos OLS em 100 ul de tampão TE 0,1. Executar as bibliotecas de oligonucleótidos sobre um 10% de TBE-ureia desnaturante em gel de poliacrilamida. Coloque cerca de 1 pmol por pista e mancha com mancha fluorescente ssDNA-sensível para avaliar a sua qualidade (Figura 2A). Se uma banda discreta correspondente aos oligonucleótidos de comprimento completo pode ser visualizado (Figura 2A, pistas 1 e 2), excisar a fatia de gel correspondente a acrilamida e eluir oligonucleótidos em 100 ul de TE 0,1 durante a noite à temperatura ambiente com agitação. Caso contrário, continue usando o OLS suspensão de matéria. Amplificar e adicionar caudas Sfil para a biblioteca oligonucleotídeo utilizando emulsão PCR 9 </ sup>. Defina-se 50 ul de misturas de reacção de PCR como descrito na Tabela 2. Em seguida combinam-se com 300 ul mistura de óleo e agente tensioactivo da emulsão e ADN Micellula kit de purificação e de vórtice durante 5 min a 4 ° C. Reagente 1x Volume (uL) Herculase II Fusão ADN Polimerase 0,5 Tampão de reacção 5x Herculase II 10 de dNTP (10 mM cada) 1,25 BSA (20 mg / ml) 1,25 MPRA_SfiI_F Primer (25 uM) 0,25 MPRA_SfiI_R Primer (25 uM) 0,25 Modelo OLS (1-10 attomol) varia Água livre de nuclease 50 ve_content "> Tabela 2 Emulsão mistura de reacção de PCR (fase aquosa). Utilizar a concentração que dá o máximo de rendimento de produtos de amplificação, sem o aparecimento de artefactos (ver secção 1.12). Dispensar a emulsão resultante em tubos de PCR e executar 20 ciclos de PCR (2 minutos a 95 ° C, 20 x [20 s a 95 ° C, 20 seg a 55 ° C, 30 segundos a 72 ° C], 3 min a 95 ° C). Piscina e romper cada emulsão de reacção de PCR de 350 ul por adição de 1 ml de isobutanol e brevemente vórtex e, em seguida, purificar o produto de amplificação, utilizando uma coluna de purificação de ADN. Executar uma aliquota sobre um gel de agarose a 2% ou 4% para verificar a amplificação livre de artefacto (Figura 2B). Figura 2: Preparação de bibliotecas de síntese de oligonucleótidos. UM) </sTrong> Três bibliotecas síntese oligonucleotídeo matérias diferentes (MQO) executado em desnaturante 10% TBE-uréia géis de poliacrilamida. As bandas correspondentes a oligonucleótidos de comprimento total (*) pode ser visualizada e excisada a partir de bibliotecas de 1 e 2 Biblioteca 3 contém os contaminantes que interferem com a purificação PAGE. Se este for o caso, seguir diretamente para a amplificação de PCR. B) produtos de aberto e de emulsão de amplificação por PCR da mesma biblioteca de oligonucleótidos corrida num gel de agarose. Amplificação por PCR de bibliotecas de oligonucleotídeos complexas freqüentemente cria produtos quiméricos e outros artefatos que podem aparecer como bandas superiores e inferiores. Emulsão PCR pode minimizar esses artefatos. 2 Construção da Biblioteca Prepara-se uma estrutura do plasmideo linearizado por digestão com Sfil pMPRA1 vector a 50 ° C durante 2 horas, corrido num gel de agarose a 1%, excisão da banda de espinha dorsal (neste caso, de 2,5 kb) e purificá-lo através de uma coluna de gel de spin-purificação. Digestos produtos de PCR a partir de emulsão passo 1.4 com Sfil a 50 ° C durante 2 horas e purificar por meio de colunas de purificação de ADN. Para ligar a biblioteca de promotor-tag na estrutura do vector linearizado, configurar as reacções contendo 100 ng do produto de PCR digerido, 50 ng do esqueleto do vector linearizado e ADN-ligase de T4. Incubar durante a noite a 16 ° C e, em seguida, aquece-se a 65 ° C durante 20 minutos para inactivar a ligase. Transformar E. coli com a reacção de ligação. Para preservar a complexidade biblioteca, visam obter pelo menos 10x mais ufc do que há combinações distintas promotor-tag na biblioteca projetada. Quando o número total de marcadores é de aproximadamente 100.000, o ufc alvo pode normalmente ser conseguido através da realização de transformações paralelas 6-8 por biblioteca. Para cada transformação, combinar 50 ul electrocompetentes E. As células de E. coli com 2 ul de mistura de ligação em gelo. Transformar por electroporação, recuperar as células em 800 ul SOCpor meio de agitação a 37 ° C durante 1 hora, e, em seguida, combinam as células a partir das transformações paralelas. Para avaliar a eficiência da transformação, placa de diluições em série a partir de uma alinquot de células recuperadas em placas de LB-agar com 50-100 ug / ml de carbenicilina e incubar durante a noite a 37 ° C. Estimar ufc totais (CFU observada) x (factor de diluição) x (V – V) / V, em que V é o volume total de células recuperado e v é o volume da alíquota para as diluições em série. Ao mesmo tempo, utilizar o restante das células recuperadas para inocular 200 ml de LB suplementado com 100 ug / ml de carbenicilina. Crescer as células a 37 ° C durante a noite numa incubadora com agitador e, em seguida, isolar o ADN de plasmídeo de acordo com procedimentos normalizados. Digerir uma aliquota do plasmídeo da biblioteca isolado com Sfil a 50 ° C durante 2 horas e separado num gel de agarose a 1% para confirmar a presença dos insertos. Linearizar o plasmídeo da biblioteca por cutting entre as variantes do promotor e tags usando Kpnl e Xbal. Para maximizar a eficiência da digestão, realizar digestões de série: Primeiro, digerir com Kpnl a 37 ° C durante 1 hora e purificar usando esferas magnéticas. Em segundo lugar, digerir com Xbal com adição de 1 U de fosfatase alcalina de camarão a 37 ° C durante 2 horas, o calor inactiva a 65 ° C durante 5 min, e em seguida purificar usando esferas magnéticas. Executar uma aliquota sobre um gel de agarose a 1% para verificar a linearização completa. Se o plasmídeo não cortado é visível, o fragmento linearizado deve ser purificado em gel. Para gerar uma biblioteca MPRA adequado para transfecção em células de mamíferos, ligar uma ORF com KpnI / XbaI extremidades -compatível na biblioteca intermediário linearizado. Para preparar um fragmento ORF luc2 compatível de pMPRAdonor1, digerir este plasmídeo com Kpnl e Xbal a 37 ° C durante 1 hora e corrido num gel de agarose a 1%. Extirpar o fragmento ORF (1,7 kb neste caso) e purifica-se utilizando uma coluna de gel de purificação de centrifugação. Clonar o fragmento do ORF na biblioteca intermediário linearizado como descrito nos passos 2,3-2,8. Digerir uma aliquota (correspondendo a 1-2 ng) da biblioteca MPRA com Kpnl a 37 ° C durante 1 hora e corrido num gel de agarose a 1%. Se a biblioteca digerido é executado como uma única banda, avance para a secção 3 Se forem observadas bandas adicionais (correspondendo tipicamente a transição de construções intermédios), a biblioteca pode ser ainda purificado como se segue: Digerir 3-5 ug da biblioteca contaminado com Kpnl a 37 ° C durante 1 hora e corrido num gel de agarose a 0,8% durante a noite a 4 ° C. Excisar a banda correcta biblioteca, purificar o ADN utilizando uma coluna de purificação de gel de rotação e realizar a auto-ligação de alta concentração utilizando a ligase de ADN de T4 a 37 ° C durante 1 hora. Em seguida, repetir a transformação e isolamento final, biblioteca de ADN, tal como descrito na etapa 2.8. 3 Transfection, perturbação, e Isolamento de RNA Para cada transfecção independentes, o número necessário de cultura de células (tal como determinado pela complexidade da biblioteca MPRA, ver discussão) em meio apropriado. Por exemplo, a cultura de células HEK293T / 17 em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e L-glutamina / penicilina / estreptomicina. Células de cultura durante pelo menos duas transfecções independentes para cada biblioteca e condição experimental. Transfectar as células cultivadas com plasmídeos MPRA. O método e as condições de transfecção deve ser optimizada para cada tipo de célula. Para cada uma das amostras transfectadas, reter-se uma alíquota (50-100 ng) de ADN de plasmídeo como controlo correspondente. Por exemplo, transfectar 0,5 x 10 7 HEK293T / 17 células cultivadas para ~ 50% de confluência numa placa de cultura de 10 centímetros, com 10 ug de plasmídeo de DNA em 1 ml de Opti-MEM I Reduced Serum Medium, utilizando 30 ul de Lipofectamina LTX e 10 ul de reagente Além disso. Retirar a mistura de transfecção após 5 horas e permitir que océlulas recuperar durante 24-48 hr. Opcionalmente, execute qualquer perturbação necessária para ativar seqüências regulatórias ao contexto ou dependentes de sinal na biblioteca projetada. Colher as células e isolar ARN poli (A) + ARNm utilizando colunas padrão de oligo (dT) celulose ou pérolas utilizando as instruções do fabricante. Assegure-se que a capacidade máxima de ligação das colunas ou grânulos exceder a quantidade total de ARNm esperado a partir das células colhidas. Por exemplo, o rendimento esperado da seção 3.3 é de cerca de 0,5-2,5 mg mRNA. 4. Tag-Seq Para eliminar o arraste de ADN do vector a partir dos lisados ​​de células transfectadas, o tratamento de cada uma das amostras de mRNA de 20 ul com 1 ul Turbo ADNase (2 U) e 2,3 ul de tampão 10x turbo ADNase a 37 ° C durante 1 h, adicionar 2,4 mL de reagente de DNase Turbo Inactivação pelo RT durante 5 min, com agitação, de centrifugação a 10.000 g durante 90 segundos, e, em seguida, transferir a solução para um tubo fresco. Verifique pureza através da realização de PCR, como descrito na secção 4.6 em 60-100 ng de cada amostra de mRNA, e depois executar os produtos em gel de agarose. Se os fragmentos específicos são visíveis (0,25 kb se usando pMPRA1 com luc2), coluna de purificar o mRNA tratada e, em seguida, repetir o tratamento DNase. Para gerar bibliotecas de sequenciamento Tag-Seq, converter mRNA repórter de cDNA e adicione adaptadores de sequenciamento por PCR. Defina-se misturas de iniciadores de ARNm / IF, tal como descrito na Tabela 3. Incubar a 65 ° C durante 5 min, em seguida, colocar em gelo. Em paralelo, criar reacções de síntese de cDNA, como descrito na Tabela 4. Reagente 1x Volume (uL) amostra de ARNm (400-700 ng total) 8 Oligo-0DT (50 uM) 1 de dNTP (10 mM cada) 1 ove_content "> Tabela 3 ARN / transcrição reversa mistura de iniciadores para a síntese de cDNA. Reagente 1x Volume (uL) 10x SuperScript III RT buffer 2 MgCl2 (25 mM) 4 DTT (0,1 M) 2 RNaseOut (40 U / ul) 1 SuperScript III (200 U / ul) 1 Tabela 4 Mistura de reacção de síntese de cDNA. Suavemente combinar ARNm / RT iniciador mistura com misturas de síntese de cDNA. Incubar a 50 ° C durante 50 min, 85 ° C durante 5 min e, em seguida, colocar em gelo. Finalmente, incubar com 2 U de ribonuclease H, a 37 ° C durante 20 min. Defina-se reacções de PCR como descrito na Tabela 5 com 4-6 ulmistura de reacção de cDNA ou 50 ng de plasmídeo repórter como modelos. Em seguida, realizar a amplificação por PCR (95 ° C durante 2 min, 26 x [95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg], 72 ° C durante 3 min). Reagente 1x Volume (uL) 2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix 25 TagSeq_P1 Primer (25 uM) 0,5 TagSeq_P2 Primer (25 uM) 0,5 Molde (mRNA, cDNA ou a mistura de ADN de plasmídeo) varia Água livre de nuclease 50 Tabela 5 mix reação Tag-Seq PCR. Executar os produtos de PCR através de um gel de agarose a 2%, faixas especiais de consumo correspondentes aos amplicons biblioteca de tags-Seq (0,25 kb se usandopMPRA1 com luc2) e purificar estas usando colunas de giro de purificação em gel. Pool, desnaturar e sequenciar os amplicons Tag-Seq purificadas diretamente com um instrumento seqüenciamento Illumina. Filtro de baixa qualidade lê, removendo tudo o que a) conter um ou mais posição com uma qualidade Phred pontuação inferior a 30 dentro da tag seqüenciado ou b) não corresponde exatamente a tag projetado. Conte o número de vezes que cada etiqueta restante aparece em cada biblioteca. Normalizar as contagens de tag de TPM (tags por milhão de etiquetas sequenciados) e, em seguida, calcular a relação de contagem de tag ARNm derivados sobre contagens tag derivado de plasmídeo para cada par de bibliotecas de sequenciação. Se várias marcas diferentes foram ligados a cada variante de sequência, use os seus rácios médios para análise a jusante.