培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ

1配列設計と合成調節活性についてアッセイすべき配列の設計と合成にMPRAを開始します。 pMPRAベクターシリーズとの互換性のために、次のテンプレートを使用して、各シーケンスを設計する：5'-ACTGGCCGCTTCACTG-のVAR -GGTACCTCTAGA- タグ -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 varはアッセイすべき配列を意味し、 タグは 、1つまたは複数の識別タグを表す'。 2つの可変領域（varとタグ ） は 、それらの間のレポーター遺伝子断片の方向性ライゲーションを容易にするためにKpnI（GGTACC）およびXbaI（TCTAGA）制限部位の対によって分離されている。さらに、2つの別個のSfiI（GGCCNNNNNGGCC）部位はpMPRA骨格に指向性ライゲーションを可能にするPCRによって追加される。可変領域は、これらの制限部位のいずれかの追加のコピーを含んではならない。必要であれば、これらの制限酵素の1つ以上が置換され得る限り代替品として1）に近いDNA分子の末端への効率的な切断を可能にし、2）ベクター配列の他の場所で切断しない。追加の詳細についての説明を参照してください。 商用ベンダーから、表1にリストされている必要なプライマーを入手します。 MPRA_SfiI_F GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG MPRA_SfiI_R GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC TAGseq_P1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGseq_P2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [インデックス] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG 表1プライマー配列。[インデックス]多重化された配列決定のために使用される6〜8ヌクレオチドのインデックスシーケンスを示している。異なる屈折率を有する少なくとも8 TagSeq-P2プライマーを取得します。すべてプライマーのHPLCまたはPAGEによって精製されるべきである。 オリゴヌクレオチドライブラリーは、商業ベンダーまたはコア施設から得られた、または製造者によって記載されるようにプログラム可能なマイクロアレイに基づくオリゴヌクレオチド合成機を用いて生成することができる。 100μlのTE 0.1バッファにOLSの製品を再懸濁します。 10％TBE-尿素変性ポリアクリルアミドゲル上のオリゴヌクレオチドライブラリーを実行します。その品質（ 図2A）を評価するのssDNA感受性蛍光染色でレーンや汚れ当たり約1ピコモルをロードします。 完全長のオリゴヌクレオチドに対応する離散的なバンドが可視化することができる場合（ 図2A、レーン1および2）、対応するアクリルアミドゲルスライスを切り出し、振盪しながら室温で一晩、100μlのTE 0.1にオリゴヌクレオチドを溶出する。そうでなければ、生のOLS懸濁液を用い進みます。 エマルジ ​​ョンPCR 9を使用して、オリゴヌクレオチドライブラリーへのSfiI尾を増幅し、追加</ SUP>。 表2に記載したように、50μlのPCR反応混合物をセットアップします。その後、4℃で5分間、300μlのMicellula DNAエマルジ ​​ョンからの油と界面活性剤の混合物および精製キットおよび渦と組み合わせる。 試薬 1倍容量（μL） ヘラクレスII融合DNAポリメラーゼ 0.5 ヘラクレスII反応緩衝液を5倍 10 のdNTP（それぞれ10mM） 1.25 BSA（20 mg / ml）を 1.25 プライマーMPRA_SfiI_F（25μM） 0.25 プライマーMPRA_SfiI_R（25μM） 0.25 OLSテンプレート（1-10 attomol） 変わるヌクレアーゼフリー水 50 ve_content "> 表2エマルジ ​​ョンPCR反応混合物（水相）。 アーティファクトの出現なしに増幅産物の最大収量が得られる濃度を使用してください（セクション1.12を参照）。 PCRチューブに得られたエマルジョンを分配し、95℃（2分20サイクルのPCRを行い、20×[95℃で20秒、55°C、72°Cで30秒、20秒]、95℃で3分間°C）。 プールDNA精製カラムを用いて増幅産物を精製し、次いでイソブタノールを1ml添加​​し、短時間ボルテックスし、そしてにより各350μlのエマルジョンPCR反応を破壊する。 アーチファクトのない増幅（ 図2B）を確認するために、2％または4％アガロースゲル上でアリコートを実行する。 オリゴヌクレオチド合成ライブラリーの調製図。A） </s·チョン>三つの異なる生のオリゴヌクレオチド合成ライブラリ（OLS）は、10％TBE-尿素変性ポリアクリルアミドゲル上で実行されます。完全長オリゴヌクレオチド（*）に対応するバンドを可視化し、ライブラリ1から切り出し、2ライブラリ3は、PAGE精製を妨害する汚染物質が含まれていることができます。この場合は、アガロースゲル上で同一のオリゴヌクレオチドライブラリーのランの開放およびエマルジ ​​ョンPCR増幅のPCR増幅。B）製品に直接進む。複雑なオリゴヌクレオチドライブラリーのPCR増幅は、頻繁に上位と下位のバンドとして表示されることがあり、キメラ製品、その他の成果物を作成します。エマルジョンPCRは、これらの成果物を最小限に抑えることができます。 2ライブラリー構築 1％アガロースゲル上で泳動し、2時間、50℃でのSfiIを有するベクターpMPRA1を消化することによって線状化プラスミドバックボーンを準備し、（この場合、2.5キロバイト）をバックボーンバンドを切り出し、ゲル精製スピンカラムを用いて精製する。 ダイジェスト2時間、50℃でのSfiIとステップ1.4からのエマルジ ​​ョンPCR産物およびDNA精製カラムを用いて精製する。 、線状化ベクターバックボーンにプロモーター – タグライブラリを連結するために消化したPCR産物100ngの、直線化ベクター骨格およびT4 DNAリガーゼ50ngのを含む反応を設定します。 16℃で一晩インキュベートし、次にリガーゼを不活性化するために20分間65℃で加熱する。 E.トランスフォームライゲーション反応で大腸菌 。ライブラリの複雑さを維持するために、設計されたライブラリ内の個別のプロモーター – タグ組み合わせが存在するよりも、少なくとも10倍以上のCFUを得ることを目指しています。 タグの合計数​​は約10万である場合、ターゲットのcfuは、典型的には、ライブラリごと6-8パラレル変換を実行することによって達成することができる。 各形質転換のために、50μlのエレクトロコンピを組み合わせる氷上の連結混合物2μlを持つ大腸菌細胞 。エレクトロポレーションによりトランスフォーム、800μlのSOCの細胞を回収1時間37℃で振とうによって培地、その後、パラレル変換から細胞を兼ね備えています。 50〜100 / mlのカルベニシリンを含むLB寒天プレート上で回収された細胞のalinquotから、プレート連続希釈を形質転換効率を評価し、37℃で一晩インキュベートする。 / V、Vが回収された細胞とvの全容積で連続希釈に要した一定分量の体積である-総CFUとして（観測CFU）×（希釈倍率）×（V V）を推定する。 同時に、回収された細胞の残りは100μgの/ mlのカルベニシリンを補充した200ミリリットルのLBに接種するために使用する。シェーカーインキュベーター内で37℃で一晩、細胞を成長させ、その後、標準的な手順に従って、プラスミドDNAを単離する。 2時間50℃でのSfiIを有する単離プラスミドライブラリーのアリコートを消化し ​​、インサートの存在を確認するために1％アガロースゲル上で泳動。 cでプラスミドライブラリーを直線化KpnI及びXbaIでを使用して、プロモーター変異体とタグの間にウッティング。消化効率を最大化するために、シリアル消化を実行します。 まず、1時間、37℃でKpnIで消化し ​​た磁気ビーズを用い精製する。第二に、2時間、37℃で1 Uエビアルカリホスファターゼを添加したXbaIで消化、熱は、5分間65℃で不活性化し、その後、磁気ビーズを用いて精製する。 完全な線形化を確認するために1％アガロースゲル上でアリコートを実行する。ノーカットプラスミドが表示されている場合は、線形化された断片をゲル精製しなければならない。 哺乳動物細胞へのトランスフェクションに適しMPRAライブラリを生成するには、線形化された中間ライブラリにのKpnI / XbaIで互換の端部とのORFを連結。 pMPRAdonor1から互換luc2 ORF断片を調製し、1時間37℃でKpnI及びXbaIでこのプラスミドを消化し ​​、1％アガロースゲル上で泳動。 ORFのフラグメントを切り出し（1.7 Kこの場合、b）およびゲル精製スピンカラムを用いて精製する。 ステップ2.3から2.8に記載されているように線形化された中間ライブラリにORFのフラグメントをクローニングします。 1時間、37℃でKpnIでMPRAライブラリ（1-2μgのに対応）分量を消化し ​​、1％アガロースゲル上で実行されます。消化されたライブラリが単一のバンドとして実行する場合、追加のバンドが認められた場合には、（通常は中間の構築物のキャリーオーバーに相当）のセクション3に進んで次のように、ライブラリは、さらに精製することができる。 1時間、37℃でKpnIで汚染されたライブラリの3-5μgのを消化し ​​、4℃で一晩0.8％アガロースゲル上で実行されます。 、正しいライブラリバンドを切り出し、ゲル精製スピンカラムを用いてDNAを精製し、1時間37℃で高濃度T4 DNAリガーゼを使用してセルフライゲーションを行う。ステップ2.8で説明したようにその後転換および最終ライブラリーDNAの単離を繰り返します。 3 Transfection、摂動、およびRNAの単離それぞれ独立したトランスフェクション、文化、適切な培地中の細胞に必要な数（MPRAライブラリの複雑さによって決定されるように、ディスカッションを参照）。例えば、DMEM中で培養HEK293T / 17細胞を、10％FBSおよびL-グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。各ライブラリおよび実験条件について、少なくとも2つの独立したトランスフェクションのための培養細胞。 MPRAプラスミドを用いて培養細胞をトランスフェクション。トランスフェクション方法および条件は、各細胞型について最適化されなければならない。各トランスフェクトサンプルについて、一致させた対照として、プラスミドDNAの一部（50〜100 ngの）を保持。 例えば、1ミリリットルのOpti-MEM中10μgのプラスミドDNAを用いた10cmの培養皿内の約50％コンフルエンスまで増殖させた0.5×10 7 HEK293T / 17細胞をトランス私は30μlのリポフェクタミンLTXと10μlのPLUS試薬を使用した低血清培地。 5時間後、トランスフェクション混合物を削除し、許可する細胞は24〜48時間回復する。 必要に応じて、設計されたライブラリ内の文脈や信号依存調節配列を活性化するために必要な摂動を行う。 細胞を採取し、そのメーカーの指示を使用して、標準的なオリゴ（dT）セルロースカラムやビーズを使用してポリ（A）+ mRNAを単離する。 カラムやビーズの最大結合容量は採取された細胞から期待するmRNAの総量を超えていることを確認してください。例えば、セクション3.3から予想される収量は約0.5〜2.5μgのmRNAである。 4。タグ配列トランスフェクトされた細胞溶解物からベクターDNAのキャリーオーバーをなくすために、で2.4μlのターボDNアーゼ不活性化試薬を、1時間、37℃で1μlのターボのDNase（2U）と、2.3μlの10倍のターボのDNaseバッファーで各20μlのmRNA試料を扱う追加その後、混合、90秒10,000 gで遠心分離し、新しいチューブにソリューションを移すとの5分間のRT。 確認する各mRNAサンプルの60〜100 ngの上のセクション4.6で説明した後、アガロースゲル上で製品を実行するようにしてPCRを行うことにより、純度。 （luc2でpMPRA1を使用している場合は0.25キロバイト）特定のアンプリコンが表示されている場合、その列は、処理されたmRNAを精製した後、DNase処理を繰り返します。 、タグ配列のシーケンシングライブラリーを作製cDNAにレポーターmRNAを変換して、PCRによる配列決定アダプターを追加します。 表3に記載したようにmRNAを/ RTプライマー混合物をセットアップします。その後、氷上に置き、5分間65℃でインキュベートする。 表4に記載したように並行して、cDNA合成反応をセットアップする。 試薬 1倍容量（μL） mRNAサンプル（400〜700 ngの合計） 8 オリゴ0dT（50μM） 1 のdNTP（それぞれ10mM） 1 cDNA合成のため ove_content "> 表3 RNA /逆転写プライマーミックス。 試薬 1倍容量（μL） 10倍のスーパースクリプトIII RTバッファー 2 のMgCl 2（25mMの） 4 DTT（0.1M） 2 RNaseOut（40 U /μl）を 1 スーパースクリプトIII（200 U /μl）を 1 表4 cDNA合成反応混合物。 ゆっくりするmRNA / RTプライマーがcDNA合成ミックスと混合兼ね備えています。 50分、5分、85℃、50℃でインキュベートした後、氷上に置きます。最後に、20分間37℃で2 UリボヌクレアーゼのHでインキュベートする。 4-6μlの表5に記載したようにPCR反応をセットアップしますcDNA反応混合物または鋳型として50 ngのレポータープラスミド。そして（3分間、72°C [30秒間、30秒間、30秒間95°C 72°Cで55°C]を2分間、26 xに対して95°C）PCR増幅を行う。 試薬 1倍容量（μL） PfuUltra II HotStartのPCRマスターミックスの2倍 25 プライマーTagSeq_P1（25μM） 0.5 プライマーTagSeq_P2（25μM） 0.5 テンプレート（mRNAは、cDNAの混合物またはプラスミドDNA） 変わるヌクレアーゼフリー水 50 表5タグ配列のPCR反応ミックス。 2％アガロースゲルでPCR産物を実行し、タグ配列のライブラリアンプリコンに対応する物品のバンド（0.25キロバイト使用している場合luc2とpMPRA1）、これらを用いてゲル精製スピンカラムを精製する。 プール、イルミナシーケンシング装置と直接、精製タグ配列アンプリコンを変性させ、配列決定する。 低品質a）はシーケンスされたタグ内に30未満のスコアまたはb）正確に設計されたタグと一致していないのPhred品質で一つ以上の位置が含まれているすべてのことを削除することで読み込みフィルター。残りの各タグは、各ライブラリに表示された回数をカウントします。 TPMに（百万配列を決定したタグごとにタグ）タグ数を正規化した後、シーケンシングライブラリの各ペアのためのプラスミド由来のタグカウントオーバーのmRNA由来のタグカウントの比を計算する。複数の異なるタグが各配列変異体に結合させた場合には、下流の解析のために彼らの中央値の比率を使用しています。