16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama
Summary
Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.
Abstract
Mikrobiyal ekolojide önemli sorulardan biri "kim var?" Olan bu soru çeşitli araçları kullanarak cevap, ancak uzun ömürlü altın standartlardan biri etki düzeyinde PCR tarafından oluşturulan 16S ribozomal RNA (rRNA) gen amplıkonları sıralamak için olabilir genomik DNA'dan amplifiye reaksiyonları. Geleneksel olarak, bu klonlama ve Sanger (kapiler elektroforez) PCR amplikonlarının dizilemesi ile gerçekleştirilmiştir. Gelecek nesil dizileme gelişi müthiş basitleştirilmiş ve 16S rRNA gen sıralama için sıralama derinliği artmıştır. Benchtop sıralayıcıların tanıtımı şimdi küçük laboratuvarlar gün bir konuda in-house kendi 16S rRNA sıralamayı gerçekleştirmek için olanak sağlar. Burada, bir tezgah üstü nesil dizi kullanılarak, 16S rRNA gen amplikon dizileme için bir yaklaşım ayrıntılı olarak verilmiştir. Çevresel DNA dizi analizi ilk adaptör ve barkod içeren primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir. Daha sonra emülsiyon, PCR yoluyla küresel parçacıklar kuple edilir. Parçacıklar l vardırBir tek çip üzerinde oaded ve çip dizisi yapıldı ve bundan sonra sıralama makinesi içinde eklenir. Sekanslar, fastq biçiminde alınır, filtre edilmiş ve barkod okur numune üyelik oluşturmak için kullanılır edilir. Daha sonra kamuya mevcut araçları kullanarak analiz edilir okur süzülür ve binned. Okur bir örnek analiz Mothur verilen yazılım paketi içinde bir sınıflandırma-bulma algoritması ile sınıflandırıldı. Burada özetlenen yöntem, basit, ucuz ve basittir ve devam eden genomik devrimden yararlanmak küçük laboratuarları yardımcı olmalıdır.
Introduction
Çevresel bir numunesi içinde ihtiva edilen genetik bilgilerin tamamını hedef olarak metagenomic dizileme çok güçlü bir teknolojidir. Av tüfeği sıralama, büyük-insert kütüphaneler ve amplikon sıralama dahil metagenomic sıralamanın farklı tatlar vardır. Amplikon dizisi oluşturma genel olarak düzenlenebilir, bir tek genomik bölgeden göreceli olarak ucuz, hızlı ve okur üretmek mümkün olma avantajını sunmaktadır. Ayrıca, amplikonu sıralama için veri analizi iş akışı çoğunlukla standardize edilmiştir. Bu PCR dayalı olduğundan Ancak, tüm eksik özgüllük, eksik kapsam ve astar ile ilgili önyargıları en iyi yarı-kantitatif bu yaklaşımı yapar 1,2, eğilimlendireceği vardır. Birçok fonksiyonel bölgeleri genomik genler de dahil olmak üzere, amplikon, sıralama için hedef olabilir, ama en popüler seçenek bir topluluk profili oluşturmak amacıyla, örneğin, 16S rRNA geni gibi marker genleri olarak kullanım için vardır. Geleneksel olarak, 16S rRNA gen amplikon sequencing E'de klonlama dahil emek yoğun teknikler kullanılarak gerçekleştirilmiştir E. coli, koloni toplama ve izole edilen plasmidler üzerindeki Sanger dizileme ile ekstraksiyon ve ardından plazmid, ve dolayısıyla, çalışmaların çoğu numune başına 100'den daha az klon analiz edilmiştir. Yeni nesil dizileme iki önemli ilerlemeler getirdi: en önemlisi sıralama reaksiyonlar ve kitlesel paralelleştirmeyi şablonları klonal ayrılmasını bir dizi gen parçaları eklemek için gerek kalmadan. Bu son derece 16S rRNA dizilemesi 3 amplikonu için bir "Renaissance" ile sonuçlanan, hemen geri birçok çevresel Mikrobiyoloji çalışmaları rutin bir özellik olarak bir 16S rRNA gen amplikonların sıralama, basitleştirmiştir.
2005 4 Roche 454 dizileme gelişiyle bu yana, diğer birkaç nesil dizileme teknolojileri piyasaya çıktı (örn, Illumina, Katı, PacBio). Tezgah üstü dizisinin Daha yakın zamanda, girişrs küçük laboratuarlara büyük dizileme merkezlerine kez özel sıralama kapasitesini getirdi. Beş Benchtop makineleri mevcuttur: 454 GS Junior Ion Torrent Kişisel Genom Makinesi (PGM) ve Proton ve Illumina MiSeq ve NextSeq 500. tüm bu dizicilerini az sunan en YARIZAMANLI daha vadede ve dolar başına daha az baz başına okur ise ölçek sequencers, onlar hızlı, daha esnek ve düşük satın alma ve çalıştırma maliyetleri küçük akademik laboratuvarlar için onlara uygun hale getirir. Çalışmaların bu tip, genel olarak bir sekanslama derinliğine gerekli değildir, çünkü, özellikle de masa üstü sekanslayıcı çevresel Mikrobiyoloji çalışmalarda amplikon, küçük genomu ve düşük karmaşıklık metagenome sekanslaması için uygundur. Örneğin, genellikle 16S rRNA gen dizileme sayısını inceleyen için multi-milyon veri setlerini 5 okur gibi aynı desen üretebilirsiniz okur 1.000 ~ olarak, numune başına okur şeyden olmadığı kabul edilmektedir. Söyledikten, tezgah üstü sonraki generatio n sequencers hala maksimal verimi ile dizi büyük miktarda veri oluşturmak ~ 35 Mbp (454 GS Yeni) ~ 2 Gbp (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 Gbp (Illumina MiSeq) ve en çevre mikrobiyolojisi çalışmaları için daha yeterli ~ 100 Gbp (Illumina Sonraki Dizi 500),.
Benchtop sekanslayıcılar kullanılarak 16S rRNA amplikonlarının nesil dizileme yakın ortamlarda çeşitli uygulanmıştır. Örneğin, İyon Torrent PGM toplum için kullanılır olmuştur petrol kumları madencilik etkilenen sedimanlar, hidrokarbon-kirlenmiş Arctic toprakların 8,9 yetiştiricilik sistemleri 7, devinimiyla, özellikle yüksek pH ve düşük geçirgenliği 6 vardı uranyum maden atıklarının analiz ve insan ve hayvan organlarının 13-16, kirlenmiş topraklarda 12 ekilen söğütler ve anaerobik çürütücü 17 rizosferde bir Athabasca Nehri 10,11 dan biyofilm.
Bu katkı detaylı bir tezgah üstü nesil sequencer (Ion Torrent PGM) kullanarak evde 16S rRNA gen amplıkonları sıralamak bizim yaklaşım olarak jove_content ">. DNA izolasyonundan sonra, 16S rRNA genleri içeren etki alanı düzeyinde bakteriyel primerler kullanılarak yükseltildi edilir dizileme adaptörler ve benzersiz örnek özgü dizileri (barkod). Amplıkonlar eşit mol oranında, arıtılmış, miktarı ve bir araya getirilmiştir. Örnekler daha sonra bir araya getirilmiş klonal bir emülsiyon PCR ile amplifiye edilmiş ve sekans işlemi uygulanır. Elde edilen diziler (halka açık biyoenformatik aletleri kullanılarak analiz edilir örneğin, Mothur).Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yöntem basit ve ucuz olduğunu ve birçok laboratuarlar metagenomic sıralama gücünü erişmek için izin vermelidir. , Kullanılan sekanslama platforma bağlı olarak değişmekle birlikte, bir kez kütüphaneler sürecinin en otomatize edilir çok az eller süresi gereklidir inşa edilir. Burada kullanılan sekanslama platformun (iyon sel PGM) için tam bir prosedür çalışma iki gün içinde gerçekleştirilebilir. PCR, 36 numune amplifikasyon: 36 örneklerinin 25 $, jel saflaştırma ve PicoGreen DNA kantitatif aşağıdaki gibidir: (Eylül 2013) yazma Şu anda, yukarıda ayrıntılı olarak örnek ile ilgili reaktif maliyetlerdi $ 125, bir emülsiyon PCR ile bir araya getirilmiş amplikonu numune için : $ 550 ya da numune başına 15 $ veya kalitesi filtreli okuma başına 0,0015 $ toplam 250 $, $ 150 ve sıralama reaktifler. Bu fiyat, enstrüman hizmeti sözleşmesi, enstrüman amortisman, teknisyen maaş ve laboratuvar alanı kullanımını içermez.
örneklerin her biri için, okur çadır "> en önemli adımlardan biri, benzer sayıda almak üzere, eşit molar oranda tüm ürünleri havuzu etmektir. PicoGreen miktar burada kullanıldığı, fakat diğer yöntemler de, daha az hassas, uygun olabilir (örneğin, UV ölçümü, jel esaslı ölçüm). bile en doğru olarak gösterir ve havuzu yaparak, numune başına okur sayısında bir değişkenlik vardır ve Tablo 2'de ayrıntıları verilen tipik bir çalışma süreci içinde, bir ikinci 4380 32750 arasında değişir 10.338 arasında bir ortalama okuma ile okur. örneği (40-50 daha fazla) çok sayıda işleme durumunda, tek bir sütun jeli ile arıtma bir katı boyut kesilmesi ile levha veya saflaştırma ile boncuk jel saflaştırma ile ikame edilebilir (örneğin, AMPure boncuk) .Bugüne kadar, 16S rRNA geni için en çok kullanılan yeni nesil dizileme teknolojisi, bu protokolde kullanılan 454. İyon Torrent sıralama teknolojisi kavramsal çok benzer olduğunu454 ve her iki teknoloji dizileme hataların aynı tür yatkındır. Şaşırtıcı değil Ion Torrent dizileme 454 dizileme 10 çok benzer sıralama sonuçlardan dolayı gösterilmiştir. Son zamanlarda, birçok araştırmacı 16S rRNA gen amplikonu dizileme 18,19 için Illumina teknoloji kullanımını araştırdı. Her durumda, bu yöntemde en son tarif edilen şekilde, bu sekans teknolojilerini için gerekli olan adaptörler ve barkod eşleştirmek için, füzyon primer dizileri değiştirerek Illumina MiSeq veya 454 GS Junior gibi diğer tezgah sequencer şu anki protokolünü adapte kolay olurdu Illumina MiSeq 19 için. Alternatif olarak, araştırmacılar adımları burada ayrıntılı protokolün 1 ve 2 takip ve emülsiyon PCR ve sıralama gerçekleştirilir olacağını bir sıralama merkezine toplanmış amplıkonları gönderebilir.
16S rRNA gen kesilmiş ve Mothur kullanarak sınıflandırılır, ama birçok diğer analizler yapılabilir edildi okur16S rRNA gen amplikonları. Örneğin, p çeşitlilik de ana hatları çizilen prosedür kullanılarak her numune çifti arasındaki mesafeleri hesaplamak Unifrac ile değerlendirilebilir http://unifrac.colorado.edu/ 20. Alfa indeksler ve her bir numunenin işletme taksonomik birimlerinin sayısı AmpliconNoise 21 gibi QIIME olan araçlar kullanılarak ya da Mothur içinde Huse ve ark. 22 ve kullanılabilir tarafından ana hatları çizilen prosedür kullanılarak hesaplanabilir.
Burada kullanılan primerler 16S rRNA geninin değişken bölgeler 3 ve 4, büyütülmüş, ancak bir çok diğer bölgeler hedeflenebilir. Bu çalışmada, 16S rRNA genleri bitki malzemesinden büyütülmüş ve primerin seçimi kloroplast 16S rRNA geninin 23,24 genleşmesini önlemek için yapıldı. Ürün uzunluğu, taksonomik güç ve kullanışlılık 25,26 vadede farklılık mevcut diğer primerler geniş bir çeşitlilik vardır. Bununla birlikte, tüm durumlarda 200-400 bp güvenilir tür düzeyinde sınıflandırılmış olamaz 16S rRNA geninin okur ve analizler cinsi ve daha yüksek taksonomik seviyelere sınırlıdır. Türler seviyesi bilgileri cpn60 ve rpoB genler 27,28 gibi, ihtiyaç duyulması halinde diğer genler daha uygun olabilir. Analitik araçların gücü, sıralama ve artar maliyet Gelecek köklü damlaları mümkün av tüfeği metagenomics tarafından 16S rRNA gen sıralamasını değiştirmek için yapmak olabilir, ama o zamana kadar 16S rRNA gen dizileme çevresel mikrobiyoloji altın standart olmaya devam etmektedir.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number |
| Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 |
| Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 |
| Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 |
| HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 |
| Primers and probes | IDT | NA |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
| BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |
Referências
- Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
- Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
- Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
- Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
- Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
- Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
- Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
- Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
- Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
- Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
- Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
- Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
- Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
- Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, . Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
- Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: ‘RePOOPulating’ the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
- Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
- Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
- Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
- Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
- Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
- Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
- Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
- Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
- Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).
