Un protocolo para infectar<em> Caenorhabditis elegans</em> Con<em> Salmonella typhimurium</em
Summary
C. elegans se ha convertido en un nuevo modelo genético para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Aquí se describe un protocolo para infectar C. elegans con Salmonella typhimurium, junto con la técnica de RNAi interferencia de doble hebra para examinar el papel de los genes del huésped en la defensa contra la infección por Salmonella.
Abstract
En la última década, C. elegans se ha convertido en un organismo invertebrado para estudiar las interacciones entre los hosts y patógenos, incluyendo la defensa del huésped contra bacterias gram-negativas bacteria Salmonella typhimurium. Salmonella establece una infección persistente en el intestino de C. elegans y resulta en la muerte temprana de los animales infectados. Un número de mecanismos de la inmunidad se ha identificado en C. elegans para defenderse de las infecciones por Salmonella. La autofagia, una vía de degradación lisosomal conservadas evolutivamente, se ha demostrado que limitar la replicación de Salmonella pt C. elegans y en los mamíferos. Aquí, un protocolo se describe para infectar C. elegans con Salmonella typhimurium, en la que los gusanos están expuestos a la Salmonella por un tiempo limitado, similar a la infección por Salmonella en los seres humanos. infección por Salmonella acorta significativamente la vida útil de C. elegans </ Em>. Usando el gen de la autofagia esencial BEC-1 como un ejemplo, se combinaron este método de infección con C. elegans alimentación RNAi enfoque y mostró este protocolo puede ser utilizado para examinar la función de C. genes del huésped elegans en la defensa contra la infección por Salmonella. Desde C. elegans todo el genoma RNAi bibliotecas están disponibles, este protocolo permite a la pantalla exhaustivamente para C. genes elegans que protegen contra la Salmonella y otros patógenos intestinales utilizando RNAi bibliotecas de todo el genoma.
Introduction
La vida libre de nematodos Caenorhabditis elegans suelo es un simple y manejable de forma genética organismo modelo utilizado para estudiar muchas cuestiones biológicas. C. elegans existe predominantemente como hermafroditas autógamas. Los varones son generados espontáneamente por la no disyunción del cromosoma X durante 1,2 gametogénesis. En la presencia de abundante comida, C. elegans desarrollar continuamente a través de cuatro estadios larvarios a adulto. La temperatura también influye en C. desarrollo elegans; desarrollo más rápido se observó a temperaturas más altas. En el laboratorio, C. elegans se cultiva a una temperatura estándar de 20 ° C en placas de agar con cabeza de serie bacteria Escherichia coli (cepa OP50) como alimento 1,2.
En la última década, C. elegans se ha convertido en un organismo invertebrado para estudiar las interacciones huésped-patógeno 3-5. En la naturaleza, C. elegans come bacterias como su nutrien1,2 t fuente. Su comida normal de laboratorio bacteriana, OP50, puede ser fácilmente sustituido con otros patógenos para examinar las interacciones entre C. elegans y cualquier patógeno elegido. En estas condiciones, el intestino es el sitio primario de la infección. De hecho, se ha demostrado una amplia gama de patógenos bacterianos para infectar letalmente C. elegans 3-5.
La bacteria Salmonella gramnegativos es un patógeno gastrointestinal que causa la enfermedad transmitida por los alimentos humanos en todo el mundo 6,7. C. elegans es un buen modelo de acogida de Salmonella typhimurium ya que esta bacteria se replica y exhibe las infecciones intestinales persistentes 8-10. C. elegans ha sido utilizado para identificar tanto novedoso y anteriormente conocido virulencia de Salmonella factores 11. Curiosamente, la C. sistema inmune elegans limita con éxito la replicación de Salmonella. Se ha informado anteriormente de que no habilition de genes autofagia hace que el aumento de la replicación de Salmonella pt C. elegans, lo que resulta en la muerte temprana de los gusanos infectados 10. Macroautofagia (aquí referido como la autofagia) es un proceso dinámico que implica la reorganización de las membranas subcelulares para secuestrar citoplasma y orgánulos para la entrega a los lisosomas para degradación 12. La autofagia ha sido reportado para limitar la replicación de Salmonella pt C. elegans y en los mamíferos 10,13.
El C. elegans genoma fue el primer genoma eucariota multicelular secuenciado; que es sensible a RNAi tratamiento 14-16. Por otra parte, el ARNi puede ser administrado eficazmente sometiendo gusanos de ingerir las bacterias que contienen el ARN de doble cadena del gen diana, conocido como alimentación RNAi 16,17. Genoma bibliotecas de alimentación RNAi enteras han sido generados para la selección de ARNi de todo el genoma 16,18. En la presente memoria, una infección de Salmonella Proprotocolo es, junto con alimentación RNAi para permitir pruebas de C. genes elegans de interés por su capacidad de proteger contra la infección por Salmonella.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans es un simple organismo modelo genético que come bacterias como fuente de nutrientes. Por lo tanto, es fácil de sustituir su alimentaria bacteriana normal con un patógeno intestinal para investigar las interacciones entre C. elegans y el patógeno elegido. En la presente memoria se describe un protocolo para combinar la infección por Salmonella y C. elegans alimentación RNAi tratamiento para examinar el papel de los genes del huésped en la defensa contra la infección …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a la Dra. Diane Baronas-Lowell para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Charles E. Schmidt Colegio FAU del Fondo Semilla de Ciencia y una Beca de Envejecimiento de la Fundación Médica Ellison a KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
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