Um protocolo para infectar<em> Caenorhabditis elegans</em> Com<em> Salmonella typhimurium</em
Summary
C. elegans tem emergido como um novo modelo genético para estudar as interações patógeno-hospedeiro. Aqui nós descrevemos um protocolo para infectar C. elegans com Salmonella typhimurium, juntamente com a técnica de interferência dupla vertente RNAi para examinar o papel dos genes do hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella.
Abstract
Na última década, C. elegans tem emergido como um organismo de invertebrados para estudar interações entre hospedeiros e patógenos, incluindo a defesa do hospedeiro contra bactérias gram-negativas bactéria Salmonella typhimurium. Salmonella estabelece infecção persistente no intestino de C. elegans e resulta na morte prematura dos animais infectados. Um número de mecanismos de imunidade foram identificados em C. elegans para se defender contra infecções por Salmonella. Autophagy, uma via de degradação lisossomal evolutivamente conservadas, foi mostrado para limitar a replicação de Salmonella em C. elegans e nos mamíferos. Aqui, é descrito um protocolo para infectar C. elegans com Salmonella typhimurium, em que os vermes são expostos a Salmonella por um tempo limitado, semelhante à infecção por Salmonella em humanos. infecção por Salmonella encurta significativamente o tempo de vida de C. elegans </ Em>. Usando o gene essencial autofagia bec-1 como exemplo, que combinado este método de infecção com C. elegans ARNi alimentação abordagem e mostraram que este protocolo pode ser utilizado para examinar a função de C. genes do hospedeiro elegans em defesa contra a infecção por Salmonella. Desde C. elegans genoma bibliotecas inteiras RNAi estão disponíveis, este protocolo torna possível para a tela de forma abrangente para C. elegans genes que protegem contra Salmonella e outros patógenos intestinais usando bibliotecas RNAi genômicos.
Introduction
O solo de vida livre Caenorhabditis elegans nematóide é um organismo modelo simples e geneticamente tratável usada para estudar muitas questões biológicas. C. elegans dominantemente existe como hermafroditas auto-fertilização. Os machos são gerados de forma espontânea por não-disjunção do cromossomo X durante a gametogênese 1,2. Na presença de alimento abundante, C. elegans desenvolver continuamente através de quatro fases larval ao adulto. A temperatura também influencia C. desenvolvimento elegans; desenvolvimento mais rápido é observada a temperaturas mais elevadas. No laboratório, C. elegans é cultivada a uma temperatura normal de 20 ° C em placas de agar com semeado bactéria Escherichia coli (estirpe OP50) como alimento de 1,2.
Na última década, C. elegans tem emergido como um organismo de invertebrados para estudar as interações patógeno-hospedeiro 3-5. Na natureza, C. elegans come bactérias como nutrient 1,2 fonte. Sua comida laboratório bacteriana normal, OP50, pode ser facilmente substituído por outros agentes patogénicos para examinar as interações entre C. elegans e qualquer agente patogénico escolhido. Sob estas condições, o intestino é o principal local da infecção. De facto, uma grande variedade de agentes patogénicos bacterianos tem sido mostrado para infectar letalmente C. elegans 3-5.
A bactéria Salmonella gram-negativo é um patógeno gastrointestinal que causa doenças de origem alimentar humana em todo o mundo 6,7. C. elegans é um bom anfitrião modelo para Salmonella typhimurium como esta bactéria replica e apresenta infecções intestinais persistentes 8-10. C. elegans foi utilizado para identificar novas e anteriormente conhecida virulência de Salmonella factores 11. Curiosamente, a C. sistema imunitário elegans limita com sucesso a replicação de Salmonella. Foi relatado anteriormente que inibidoition de genes autofagia torna o aumento da replicação Salmonella em C. elegans, resultando em morte precoce de vermes infectados 10. Macroautofagia (aqui referido como autofagia) é um processo dinâmico, que envolve o rearranjo de membranas intracelulares para sequestrar citoplasma e organelas para entrega do lisossoma para degradação 12. Autophagy foi reportado para limitar a replicação de Salmonella em C. elegans e em mamíferos 10,13.
O C. elegans genoma foi o primeiro genoma eucarionte multicelular seqüenciado; ele é sensível ao tratamento 14-16 RNAi. Além disso, o RNAi pode ser administrado de forma eficaz, sujeitando vermes ingerir bactérias contendo o ARN de cadeia dupla do gene alvo, conhecido como RNAi alimentação 16,17. Genoma bibliotecas inteiras de alimentação RNAi foram gerados por RNAi do genoma triagem 16,18. Nisto, uma infecção pro Salmonellatocolo está acoplado com o RNAi alimentação para permitir o teste C. elegans genes de interesse para a sua capacidade de proteger contra infecção por Salmonella.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans é um simples organismo modelo genético que se alimenta de bactérias como fonte de nutrientes. Assim, é fácil de substituir a sua comida bacteriana normal com um patógeno intestinal para investigar as interações entre C. elegans e o agente patogénico escolhido. Nisto um protocolo é descrito combinar infecção por Salmonella e C. elegans RNAi alimentando tratamento para examinar o papel dos genes do hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Diane Baronas-Lowell para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma FAU Charles E. Schmidt Faculdade de Ciências Grant Semente e uma bolsa Envelhecimento da Fundação Médica Ellison para KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
Referências
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- . The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
