От вокселей к знаниям: Практическое руководство по сегментации комплекс электронной микроскопии 3D-данных
Summary
Узким местом для сотовой 3D электронной микроскопии является выделение признаков (сегментация) в очень сложных карт плотности 3D. Мы разработали набор критериев, который обеспечивает руководство в отношении которых сегментация подход (ручной, полуавтоматический или автоматизированная) лучше всего подходит для разных типов данных, обеспечивая тем самым отправной точкой для эффективной сегментации.
Abstract
Современные подходы микроскопии 3D электронов в последнее разрешено беспрецедентный представление о 3D ультраструктурным организации клеток и тканей, что позволяет визуализацию больших макромолекулярных машин, таких как адгезии комплексов, а также более высокого порядка структуры, такие как цитоскелета и клеточных органелл в их соответствующей ячейке и контекст ткани. Учитывая присущие сложность клеточных объемов, важно сначала извлечь особенности интерес, с тем чтобы визуализации, количественного и поэтому понимание их 3D организации. Каждый набор данных определяется различными характеристиками, например, сигнал-шум, четкость (резкость) данных, неоднородность его особенностей, теснота возможностей, наличия или отсутствия характерных форм, которые позволяют легко идентифицировать, и процентных из всего объема, что конкретная область интереса занимает. Все эти характеристики должны быть рассмотреныпри принятии решения, какой подход принять для сегментации.
Шесть различных 3D наборы ультраструктурным данные были получены три различных изображений, представленные подходы: смола встроенные тонированный электронной томографии, сосредоточены ионного пучковыми и серийный блок лицо- сканирующей электронной микроскопии (FIB-SEM, SBF-SEM) мягко пятнами и сильно окрашенных образцов , соответственно. Для этих наборов данных, четыре различных подхода сегментации были применены: (1) полностью ручной модель здания с последующим исключительно визуализации модели, (2) сегментация руководство отслеживание данных с последующим поверхности рендеринга, (3), а затем полуавтоматические подходы по оказанию поверхности, или (4) автоматизированных специально разработанных алгоритмов сегментации с последующим оказанием поверхности и количественного анализа. В зависимости от комбинации набора данных характеристик, было обнаружено, что, как правило, один из этих четырех категориальных подходов превосходит другие, но в зависимости от точной последовательности критериев, MORe, чем один подход может быть успешным. На основании этих данных, мы предлагаем схему TRIAGE что классифицирует как объективные наборов данных характеристик и субъективные личные критерии для анализа различных наборов данных.
Introduction
Традиционно, электронная микроскопия (ЭМ) поле была разделена на 1) структурной биологии отрасли, используя высокую и супер-высоким разрешением ПЭМ, как правило, в сочетании с скрытые или открытые данные в среднем по расследованию трехмерную (3D) структуру макромолекулярных комплексов с определяется состав и, как правило, относительно небольшой размер 1-4, и 2) отделение клеточного изображений, в котором целые клеточные Сценарии визуализируются 1,5,6. В то время как структурная биология отрасль претерпела впечатляющее развитие в течение последних четырех десятилетий, клеточная биология отрасль в основном ограничивается двух измерениях, часто на менее чем оптимально сохранившихся образцов. Только с появлением электронного томографии в последнее десятилетие имеет сотовый биологическую ультраструктурную изображений размножены в третьем измерении 5,7, где, как правило, в среднем не может быть выполнена, как сотовые пейзажи, и, таким образом особенностях интерес, как правило, уникальны.
Хотя визуализируются клеточные сцены часто ошеломляющим для глаз, эффективной добычи из особенностей интереса и последующего количественного анализа таких весьма сложных клеточных объемов отстают, отчасти потому, что точный состав белка обычно неизвестно, поэтому делает его сложным для интерпретации этих клеточных 3D объемы. К этой дате, обширная биологическая экспертиза часто требуется для того, чтобы интерпретировать сложные томограммы, или даже чтобы выявить важные регионы и основные компоненты в объеме 3D. В дальнейших осложнений, визуализация 3D объемов удивительно нетривиальный. 3D объемы можно рассматривать и таким образом представить в виде стопок 2D-изображений. Срез на срез проверка последовательных 2D изображений уменьшает сложность, но также имеют пределы экстракции и, таким образом, количественный анализ в двух измерениях. Тем не менее, для большинства 3D-объектов, изображение 3D объемов, как только стопка последовательных плоскостей приводит к неполнойд перекос проблематику в конкретной системы 3D природе. Альтернативные способы визуального осмотра требуют либо оказание громкости или поверхности рендеринга, который данную зачастую плотный характер клеточном объема-может легко привести к затрудненным видом вложенных объектов или сокрушить пользователя вообще, что делает интерактивный руководство сегментация трудно.
Чтобы исправить эти барьеры, большое разнообразие автоматизированной выделения признаков (сегментации) подходы были разработаны, что, как правило, либо плотностно или градиент на основе 8-10. Однако, эти методы, как правило, сегмент весь объем вне зависимости от каких областях и функции могут представлять интерес для специалиста, хотя некоторые современные методы могут нацеливания на определенную особенность интереса, таких как нитей актина 11. Кроме того, программы, осуществляющие автоматическую сегментацию иногда может привести к получению большого количества суб-объема (например, при применении водосборных бассейнов immersioн сегментации), которые часто должны быть объединены вручную обратно в включающий всю функцию интереса или может быть подвергнут дальнейшей сегментации. Это справедливо особенно для сложных и многолюдных наборов данных, таким образом, наиболее рендеринга компьютерных алгоритмов не могут извлечь только особенности интерес с верности и значительные усилия курирование экспертом часто необходимы для получения желаемого сегментированный объем.
Кроме того, пользовательские решения в весьма конкретной задачи, часто публикуются в качестве научной статьи встречи, с практически не упором на что делает их широкое и всеобъемлющих инструментов доступным для исследователей, не имеющих глубокие знания области математики, информатики и / или компьютерная графика. Настраиваемый среда программирования программное обеспечение, содержащее ряд библиотек анализа изображений, может быть мощным набор инструментов позволяет пользователям эффективно создавать свои собственные модули для точного сегментирования. Тем не менее, этот подход требует добensive обучение и фон в информатике для того, чтобы воспользоваться его многочисленных функций или возможностей для анализа изображений. Можно работать в такой разносторонней программной среды для определенных наборов данных, где особенности являются более редкими, например, за счет использования мощных фигур на основе подходов, которые полагаются на уникальной геометрии "шаблонов", чтобы отделить объекты, представляющие интерес с их окружением 12,13 .
Справедливый выбор пакетов компьютерной графики визуализации существуют для интерактивного ручной сегментации и построения модели. Некоторые пакеты имеются в продаже, в то время как другие имеют академической происхождения и распространяется бесплатно, такие как: Калифорнийский университет в Сан-Франциско Chimera 14, Университет Колорадо УПМ 15, и Техасского университета Остина VolumeRover 16. Тем не менее, широкий спектр и сложность функций и возможностей эти программы обладают круче кривой обучения для еагл. Некоторые программы визуализации обеспечивают простые геометрические модели, такие как шарики и палочки разного размера, которые могут быть размещены в картах плотности для создания упрощенную модель комплексной 3D-объем. Эти модели затем позволить простые геометрические и объемные измерения и, следовательно, выходят за рамки просто "красивая картинка". Такая ручная трассировка объектов хорошо работает для томов, в которых необходимо лишь небольшое количество объектов, чтобы проследить и экстрагируют. Тем не менее, в последнее время развитие большого объема 3D ультраструктурным визуализации с использованием либо сосредоточены ионного пучка сканирующая электронная микроскопия (FIB-SEM) 17-20 или серийный блок лицо сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) 21 представляет дополнительные сложности, что размер 3D данных Наборы могут варьироваться от гигабайт до десятков и сотен гигабайт, и даже терабайт. Поэтому такие крупные 3D объемы практически недоступны в ручной выделения признаков, и, следовательно, эффективность пользователь наведением полуавтоматическое подвигДобыча Юр будет одним из узких мест для эффективного анализа 3D объемов в обозримом будущем.
Здесь представлены четыре различных подхода сегментации, которые обычно используются на большом диапазоне биологических типов изображений. Эти методы затем сравниваются для их эффективности для различных типов наборов данных, что позволяет компиляцию в качестве руководства, чтобы помочь биологам решить, что может быть лучшим сегментация подход для эффективного выделения признаков собственных данных. Как подробно руководства пользователя доступны для большинства программ, описанных, цель состоит в том, чтобы не сделать потенциальные пользователи знакомы с любой из этих определенных пакетов. Вместо этого, целью является продемонстрировать сильные стороны и ограничения этих различных стратегий сегментации, применяя их к шести например наборов данных с различными характеристиками. Благодаря этому сравнению, набор критериев были разработаны, которые либо на основе объективных характеристик образаНаборы данных 3D, такие как противоположность данных, резкости, тесноту, и сложности, или вытекают из субъективных соображений, таких как желаемой цели для сегментации, морфологии особенностей, чтобы быть сегментирован, плотность населения из особенностей интерес, то есть доля объем, занимаемый функции интереса, и, как исходить оптимально с ограниченными ресурсами, таких как время и наличия персонала. Эти различные примеры наборов данных показано, как эти объективные и субъективные критерии могут быть применены последовательно в различных комбинациях, чтобы получить спаривание некоторых подходах извлечения признаков с определенными типами наборов данных. Рекомендации, данные мы надеемся, поможет новичкам сталкиваются с большим разнообразием вариантов сегментации выбрать наиболее эффективный подход сегментации для собственного 3D-объем.
Хотя основное внимание в данной работе является выделение признаков, внимание к сбору данных и предварительной обработки данных имеет решающее значение для эффективных сegmentation. Часто окрашивание образцов может быть неравномерным, и, следовательно, потенциальные артефакты окрашивания следует рассматривать в порядке сегментации. Тем не менее, пятно обычно дает более высокую сигнал-шум, и, следовательно, требует меньше фильтрацию и другие математическую обработку клеточных объемов, которые потенциально могли бы также привести к артефактов. Соответствующие наборы исходные данные изображения должны быть приобретены при правильных настроек контрастности и камера пикселей, выровнен, и реконструирован в 3D-объем. Для томограмм, выровненные изображения реконструируются правило, с использованием взвешенных обратного проецирования, а затем набор данных, как правило, подвергаются алгоритмов шумоподавления, например, нелинейной анизотропной диффузии 22, двустороннего фильтрации 23, или рекурсивной медианной фильтрации 24. Данные изображений FIB-SEM и SBF-SEM выровнены по кросс-корреляции последовательных срезов в XY с использованием таких программ, как ImageJ 25. Контрастное усиление и фильтрацию можно применять для повышения особенностиинтерес и тем самым де-шум стек изображения. Фильтрация может быть выполнена либо на весь объем до подобъема выбор или от выбранных subvolumes, как фильтрация подходы могут быть вычислительно дорого. Вниз-выборки данных (Binning), который иногда используется для снижения уровня шума и / или уменьшения размера файла, рекомендуется только если данные были значительно выборка по сравнению с ожидаемым разрешением.
После шумоподавления, обработанные изображения могут быть сегментирован различными способами, и в центре внимания в этом исследовании на следующие четыре: (1) ручной абстрактной поколения модели через создание модели мяч и пряника, (2) руководство трассировка особенностей интерес, (3) автоматизированной порогового основе плотности, и (4) Индивидуальный автоматизированной сегментации с помощью сценария для проекта конкретного сегментации. Граница сегментация 8 и захватывающий водораздел сегментация 10 лучшие альтернативы простому порога, но тэй принадлежат к той же категории и не были явно включены в этом обсуждении.
Руководство отслеживание плотности требуется описанием элементов, представляющих интерес, нарезать на-ломтик, что позволяет сохранение оригинального плотности соответствующих субклеточном областях. Такой подход позволяет максимально контролировать процесс сегментации, но это утомительно и трудоемкий процесс.
Автоматизированные пороговые основе (и связанных с ними) подходы сегментации плотность полуавтоматические, где алгоритм выбирает пикселей на основе набора заданных пользователем параметров. Несколько академических (бесплатно) визуализации пакеты, такие как UCSF Химеры, УПМ, Фиджи 26 и VolumeRover доступны, а также коммерческий (требует платных лицензий) пакеты, и оба типа обычно включают один или несколько из этих подходов сегментации. Пакеты программного обеспечения, используемые в этой работе, чтобы проиллюстрировать эти различные методы включают в себя как коммерческие программы и академические открытые секOurce программы для вручную генерации абстрактную модель, а также ручной и автоматизированной сегментации плотности. Тем не менее, программное обеспечение с открытым исходным кодом может иногда предлагают более продвинутые варианты через возможности кастомизации.
Сравнение этих методов с использованием различных типов наборов данных привело к следующему представлению правил и указаний о том, как подойти к сегментации различных объемов 3D биологические данные, которые, насколько нам известно до сих пор не опубликованы. Таким образом, это первый систематический Сравнение различных подходов и их полезность на наборах данных с различной характеристики для пользователей с разными целями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эффективные стратегии для извлечения соответствующих функций от объемов 3D EM срочно необходимы для того, чтобы идти в ногу с цунами данных, который недавно попал биологической визуализации. В то время как данные могут быть получены в часах или днях, это занимает много месяцев, чтобы проанализировать объемы 3D в глубину. Таким образом, очевидно, что для анализа изображений стало препятствием для научных открытий; без адекватных решений для этих проблем, ученые изображений становятся жертвами собственного успеха. Это отчасти связано с высокой сложностью данных, а также макромолекулярный скученности обычно встречаются в биологических клетках, где белки и белковые комплексы границы друг с другом и по существу появляются в виде непрерывного градиента в оттенках серого плотностей. Проблема осложняется пробоподготовки и визуализации дефектов, а в некоторых случаях артефактов реконструкции изображений, что приводит к менее совершенным объемных данных, которые могут создавать проблемы для полностью автоматизированного подходаэс. Наиболее значимыми, однако, является тот факт, что эксперты в пробоподготовки, визуализации и биологической интерпретации редко хорошо разбираются в вычислительной науки, и, следовательно, требуют указания о том, как эффективно подойти извлечения и анализа функций. Поэтому, за счет использования различных примеров, протокол объясняет, как подготовить данные для сегментации, а также шаги, необходимые для ручной абстрактной поколения модели, автоматизированного плотности на основе сегментации, ручной отслеживания особенностей интерес, и индивидуальный автоматизированной сегментации. Ручные и автоматические подходы, изложенные в процедуре можно найти в большом разнообразии сегментации программного обеспечения, некоторые из которых упомянуты здесь, но другие выполняют сходные функции и одинаково хорошо подходит.
Полученные результаты показывают, что эффективность каждого из подходов 3D сегментации варьируется для каждого типа наборов данных. Несмотря на то, что различные подходы производства качественно сimilar 3D визуализации в качестве конечного продукта, количество времени и усилий, потраченных на каждом ходе процесса сегментации значительно варьировала. Рекомендации для соответствующих характеристик изображения и личных целей в сегментации подхода показаны на рисунке 5, который также пояснил, в следующих четырех подразделов. Эти критерии были применены к шести наборов данных, как показано на решение блок-схеме на рисунке 6. Несмотря на рисунках 5 и 6 являются лишь призвана обеспечить обоснование каждого набора входных данных и, как каждому из критериев были взвешены в процессе принятия решений, они не обеспечивают защиту от неправильной ориентации, а скорее как отправную точку. Есть просто слишком много критериев, которые влияют на процесс принятия решений: некоторые объективные критерии, такие как набор данных характеристик, в то время как другие являются более субъективные критерии, такие как желаемой цели. Можно с уверенностью сказать, что наборы данных, которые отображают высокий левэль контраста с острыми четкими границами, имеют особенности, которые хорошо разделены и относительно однородным (не слишком разнообразны), и обрабатываются с целью отображения модели плотности для большого числа объектов, автоматизированные подходы будут лучше, если бы не тот факт, что руководство подходы бы просто ресурс (время) -prohibitive. С другой стороны, если контрастность изображения низкая, данные размыто и, таким образом, требуется профессиональные знания, объекты переполнены, и особенности показывают большое разнообразие и, таким образом, неоднородны, не может иметь никакого другого выбора, чем ручной выделения признаков / сегментация.
Руководство Абстрагированная Модель Поколение
Руководство отведенной модель трассировки является особенно эффективным в сегментации линейные элементы, обеспечивая семена точек (шаров), которые могут быть автоматически подключенные (палочки). Такие шарики и палочки-модели может быть очень мощным, чтобы измерить длину ай ориентация такой модели и обеспечивают должным образом абстрагируется модель как для качественного осмотра и количественного анализа. Руководство отведенной поколение модели обычно используется при минимизации ресурсов, расходуемых на анализе важнее абсолютной верности формах исходных данных. Это самые успешные с линейными и однородными особенностями интерес (например, нити, трубки). Контрастность данных, четкость, и теснота не играют главную роль в определении успеха этого метода, до тех пор, как человеческий глаз может распознать объект интереса. Иногда такие модели также могут быть использованы в качестве скелета в сегменте Map 3D в зоне вокруг каркаса. Хотя модель является абстрактным, а не отражением точных плотностей, она представляет собой скелетонизированный версию плотности 3D и, таким образом, позволяет без беспорядков визуализации и качественного анализа. Количественные измерения, такие как длина может быть определена из приближенной модели. Дляпример программного обеспечения с ручной абстрактной модели поколения, пожалуйста, посетите подробную инструкцию химеры на сайте http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .
Руководство Отслеживание Особенности интересов
Руководство трассировка кисть хорошо работает практически со всеми характеристиками данных, но это также самый трудоемкий метод. Порой, это единственный метод для извлечения интересующий объект из сложного набора изображений, содержащего большое разнообразие функций, таких как тонкого и замысловатого клеточной мембраны. Один полезный инструмент предоставляется в отдельных программ позволяет интерполяции между перерывами сегментированных ломтиками, когда особенность интерес изменяется плавно. Ручной трассировки могут быть применены наиболее эффективно, если данные свежий и имеет от средней до высокой контрастности, но он также может быть использовандля более сложных наборов данных, при условии, что пользователь знаком с объектом интереса. Сложность данных может варьироваться от дискретных объектов до сложных и многолюдных наборов данных, где объекты тесно упакованных. В последнем случае, руководство сегментация может быть единственным выбором, так как автоматические подходы часто борьба за сегмент нужную громкость и извлечь слишком много или слишком мало. Сложные особенность морфологии, такие как запутанные листов или объемов, также могут быть получены этим методом. Тем не менее, пользователь должен иметь в виду, что набор данных с нескольких сложных характеристик можно разделить только если плотность населения из особенностей интерес низкий, как сегментация высокой плотностью населения из особенностей интерес становится времени непомерно. В качестве примера программного обеспечения с ручной трассировки, пожалуйста, посетите подробную инструкцию Amira в Интернете по адресу http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.
Автоматизированная Плотность основе сегментации
В отличие от ручных методов, автоматизированных подходов, как правило, меньше времени, что является важным фактором при сегментации большой стек изображений. Однако простое определение порога не могут быть менее точными, и гораздо больше времени может быть потрачено на изысканности и курирование в автоматически Географическая объема. Автоматизированная сегментация плотность основе лучше всего работает на наборах данных, которые отображают большое количество сходных черт интересов, которые все требуют сегментацию. Если данные сложнее, эти автоматизированные методы могут до сих пор служат в качестве первого шага, но, скорее всего, потребует некоторого ручного вмешательства по линии для того, чтобы указать подтом содержащий функцию интереса. Эта стратегия, как правило, хорошо работает на линейных морфологии или извитых объемов, но это редко бывает успешным с тонких извитых листов, таких какклеточных мембран. Минимальное вмешательство пользователя с автоматизированными подходов позволяет сегментацию через больших или малых объемов, в то время как расходовать ограниченные ресурсы пользователя, такие как время в обмен на высокой точностью. В качестве примера программного обеспечения с автоматизированной сегментации плотности на основе, пожалуйста, посетите подробную инструкцию Amira в Интернете по адресу http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .
Индивидуальный Автоматизированная Сегментация
Индивидуальный автоматизированный сегментация позволяет сетевой настройки алгоритмов для конкретного набора данных, но это часто специфичны для набора данных или типа данных, подходящих для ограниченного числа художественных характеристик, и не может быть легко обобщается. Процедура представлены здесь отличается от общих автоматизированных подходов сегментации, таких как водосборов погружения и другого уровня набор методов, которые полагаются на запрограммированной определения критических точек семян, а затем быстро маршируют расширения куба из этих семян пунктов. Вариация на эту тему граница сегментация, где градиент вектор информация сообщает границ объектов. В отличие от этого, настроить сценарий, который используется здесь, опирается на этапе подготовки, где пользователь вручную отслеживает несколько примеров. Через машинного обучения, конкретные алгоритмы обнаружения, а затем научиться самостоятельно распознавать свойства и характеристики данных последовательно найденные в следах. Опытные пользователи могут переквалифицироваться алгоритмы и повысить точность сегментации в том числе больше пример прослеживает, чтобы обеспечить больший набор критериев удобства. В целом, порогов и связанных с ними подходов, или даже Заказные подходы могут быть не столь полезно извлечь один признак интереса из образа со сложным разнообразием органелл или формы, как курирование может быть столь же трудоемким, как ручной трассировки.
">Стратегии Установление очередности данных и Выбор Сегментация подход
Учитывая субъективные и объективные критерии, представленные на рисунке 4 и резюме подходящих наборов данных на рисунке 5, принятия решений схема изображена на рисунке 6 может помочь эффективной оценки стратегий извлечения признаков для большого разнообразия наборов данных. Наборы данных отбирали раненых в четырех последовательных решений, каждое из которых может включать любой один из четырех соответствующих целей, а также четырех субъективных критериев, введенных на рисунке 4. В качестве примера, на фиг.6 рационально сортировке каждого из данных шести наборы показано на рисунке 3. Несомненно, для каждого набора входных данных там нет ни одного единственный путь, а разные пути через эту матрицу следующие различных критериев для принятия решений, которые могут привести то том же или другом рекомендации для сегментации данных. В то время как каждый набор данных будет иметь свой собственный набор свойств, которые не могут быть ожидаемых, шесть примеры приведены, каждый в паре с объяснением причин для проведения предпочтительной особенностью добыча / сегментации подхода. Большинство также включать предложение для альтернативного решения маршруту которое влечет использования же или другом сегментации подхода (рисунок 6).
Киноцилия является хрустящие, установленные с четко определенными границами, что делает автоматизированные подходы больше шансов на успех данных. Все особенности интерес хорошо разделены, снова отдавая автоматизированный подход. Кроме того, особенности интерес представляют похожи друг на друга, что делает его относительно однородным набор данных идеально подходит для индпошив сегментации. Наконец, целью было извлечь весь функцию, в пользу полуавтоматического подхода. Как следствие, был сделан вывод о том, что автоматизированное определение порога (сплошная зеленая линия), а также специально разработанный (например, формировать под наблюдением сегментации) подход (пунктирная зеленая линия) оба скорее всего, чтобы преуспеть на этом наборе данных.
Аналогичные критерии, хотя размещены в другом порядке в сети принятия решений, обратиться в случае бактерий. Индивидуальный подход рекомендуется отчасти потому, что этот набор данных был очень большим; следовательно, ограниченные ресурсы запретить трудоемкую ручную вмешательство / сегментации подход. В то время как определение порога бы дали приемлемые результаты, специально разработанный подход смог выполнить основной цели в исследовании, чтобы отделить округлые бактериальные формы из внеклеточной металлических отложений, расположенных либо в промежутках между бактериями или в непосредственной близости от бактерий, и, следовательно, предпочтение было отдано индивидуальный подход.
Для наборов данных стереоцилий, первое рассмотрение было желаемая цель: цель может быть либо показать всю плотностьили создавать геометрические модели. Объем интерес был людном месте, и целью было сегменте большое количество объектов, как, разделенных объектов в тем, чтобы впоследствии выполнить количественную объемный анализ, в том числе длины, цифр расстояния, ориентации и т.д. Это было полезно, что объекты Интерес в основном линейный, и это сделало геометрическую модель трассировки метод выбора. Однако, если вместо цель в том, чтобы показать всю плотность, то линейная морфологию функции, а также относительно высокий контраст с резко обозначенными границами сделает автоматизированный протокол порога возможно.
Клеточные мембраны и случаи данных митохондрии являются сложными для автоматизированных подходов в связи с их категориями художественного морфологии: запутанная листы и объемы, соответственно. Цель состоит в том, чтобы проследить клеток или митохондрий очертания точно, но есть только ограниченные ресурсы, чтобы сделать это. Кроме того, особенности ИнтерПредполагаемое сложны и не могут быть легко определяется автоматически или форму в кодировке, хотя для данных митохондрии устанавливает индивидуальные сценариев подход, для бактерий, возможно, будет применяться с дальнейшей настройки. К счастью, мембрана и митохондрии сами представляют собой лишь малую долю от всего объема и, следовательно, руководство трассировка является прямым хотя трудоемкий подход. Руководство трассировка также методом выбора для таких наборов данных, когда контраст является довольно низким, а границы достаточно размыты. В результате, даже если они составляют значительную часть наборов данных, такие запутанные листы должны быть вручную проследить, просто за счет отсутствия лучшей альтернативы.
Набор данных завода поставлена свои собственные проблемы, потому что целью было сегмент все объекты, которые плотно расположены и составляют переполненный пейзажем. Показано плотность как есть позволит измерения о форме и организации объектов, но боскольку вручную сегментации каждый нитевидные объект слишком дорого, автоматический порога работал вместо.
Различные этапы и соответствующие результаты в создании 3D-модели были показаны здесь, но что более важно, характеристики данных и личные критерии нашел, чтобы быть решающим в определении лучший путь сегментации были также выяснены. Важными характеристиками данных изображения самого включают то, что описано здесь, как отличие, тесноту, резкости, и количество различных форм или функций (например, органелл, волокна, мембраны). Субъективные критерии, которые следует рассмотреть желаемой цели сегментации (измерения / подсчета, скелетонизирован представление данных / отображения томов 3D визуализации), морфологические характеристики функции интереса (линейный, удлиненные, сетевой, комплекс, запутанная), плотность особенности интерес в отношении всего объема (доля объектов, которыеважно и нужно быть извлечены), и балансировки компромиссы расходуя ресурсы к сегментации в верности исходных данных и убывающую отдачу от инвестиций в результате постепенных улучшений для существенно более высокой распределения ресурсов.
Поле сегментации изображений значительно повзрослел за последние годы, еще нет серебряной пули, ни алгоритм или программа, которая может сделать все это. Набор данных размеры выросли из сотен мегабайт в плановом порядке десятки гигабайт, и они в настоящее время начинают превышать терабайт, что делает ручной сегментации практически невозможно. Таким образом, больше ресурсов необходимо инвестировать в умных и временных эффективных подходов извлечения признаков, которые имитируют процесс принятия решений человека. Такие усилия должны быть объединены с (1) географические информационные системы (ГИС) основе семантических иерархические базы данных (по аналогии с Google Earth), (2) методы извлечения данных (т.е., переходот вокселе к геометрического представления / объемного), совместимого с компьютерной помощь проектирования (САПР) программного обеспечения для того, чтобы значительно сократить объем данных, и, таким образом, позволяя отображать больших объемах 35, (3) методы моделирования, так как они часто используются в инженерных дисциплин, а также (4) Продвинутая анимация и кино решений возможности, в том числе анимации пролета (по аналогии с тем, что разработана для игровой индустрии).
Очевидно, эффективность выделения признаков и сегментация лежит в основе этого грядущей революции в визуализации клетки с высокой разрешающей способностью, и в то время лучше всего подходит всегда будет необходимо, принципы, представленные здесь, а также примеры того, что подход был принят для различных типов данных , обеспечит некоторую ценную информацию для принятия решения о какой подход следует принять.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at University of California Berkeley for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article.
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.
Materials
| Material Name | Company | Comments | |
| Amira | FEI Visualization Sciences Group | http://www.vsg3d.com/amira/overview | |
| Chimera | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| Photoshop | Adobe | http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html | |
| MATLAB | MathWorks | http://www.mathworks.com/ | |
| VLFeat | VLFeat | http://www.vlfeat.org/ |
Referências
- Auer, M. Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine. J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).
- Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography. Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).
- Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).
- Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction. Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).
- Chen, S., McDowall, A., et al. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).
- Meyerson, J. R., White, T. A., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging. J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).
- Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks. Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).
- Volkmann, N. A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps. Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).
- Rigort, A., Günther, D., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).
- Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation. Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).
- Lin, Z., Davis, L. S. Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0. Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).
- Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
- Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).
- Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Frangakis, A. S., Hegerl, R. Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion. Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).
- Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).
- Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering. Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- MathWorks. . MATLAB. , (2012).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).
- Vedaldi, A., Fulkerson, B. . VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).
- Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. What are Textons?. International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).
- Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).
- Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Shin, J. B., Krey, J. F., et al. Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle. Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).
- Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta. Journal of Information & Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).
