Analyse de l'altération de l'épithélium Produit par<em> Entamoeba histolytica</em> Maladies infectieuses
Summary
L'infection humaine par E. histolytica conduit à l'amibiase, une cause majeure de diarrhée dans les pays tropicaux. L'infection est initiée par l'interaction d'agents pathogènes sur des cellules épithéliales de l'intestin, provoquant l'ouverture des contacts cellule-cellule et par conséquent, une diarrhée, parfois suivie d'une infection du foie. Cet article fournit un modèle pour évaluer les premières interactions hôte-pathogène pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase.
Abstract
Entamoeba histolytica est l'agent causal de l'amibiase humaine, une cause majeure de diarrhée et abcès du foie dans les pays tropicaux. L'infection est initiée par l'interaction de l'agent pathogène aux cellules épithéliales de l'intestin. Cette interaction conduit à la rupture des structures intercellulaires tels que les jonctions serrées (TJ). TJ assurer l'étanchéité de la couche epitheliale pour séparer le tissu de l'hôte à partir de lumière de l'intestin. Des études récentes fournissent la preuve que la perturbation de la EhCPADH112 TJ en protéine de parasite est une condition préalable à E. invasion de histolytica qui est accompagné par un dysfonctionnement de la barrière épithéliale. Ainsi, l'analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans TJ démontage pendant E. invasion de histolytica est d'une importance capitale pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase. Cet article présente un modèle simple qui permet l'évaluation des interactions initiales hôte-pathogène et le potentiel d'invasion de parasites. Paramètres à analyser sont trésistance électrique ransepithelial, l'interaction de EhCPADH112 avec les récepteurs de surface épithéliales, changements dans l'expression et la localisation de marqueurs de jonction épithéliales et la localisation des molécules du parasite dans les cellules épithéliales.
Introduction
Entamoeba histolytica est un protozoaire responsable de l'amibiase humaine, une infection intestinale cellule causant l'inflammation et la diarrhée. E. histolytica infecte jusqu'à 50 millions de personnes chaque année, mais seulement 10% des personnes infectées développent les symptômes associés à l'amibiase 1. L'infection se produit lors de l'ingestion d'aliments ou d'eau contaminés contenant E. kystes histolytica. Dans l'intestin, les kystes produisent trophozoïtes vivants qui adhèrent à côlon mucine et prolifèrent 2. Trophozoïtes forment habituellement des kystes qui sont excrétés par les selles. Dans d'autres cas et pour des raisons encore inconnues, trophozoïtes briser la couche épithéliale intestinale et envahissent les tissus sous-jacents. Dans le pire des cas, ils entrent dans la circulation sanguine et affectent d'autres organes tels que le foie 3.
Briser la barrière épithéliale nécessite bouleversement des structures transmembranaires épithéliales qui maintiennent les cellules jointes. Cellules épithélialesdes contacts sont formés par le complexe constitué de jonction étanche apical (TJ), et des jonctions adhérentes (AJ), et des desmosomes 4. Les jonctions apicales sont plus TJ, et par conséquent, ils sont la première barrière offensé par E. histolytica et d'autres agents pathogènes lors de l'invasion de l'hôte. TJ sont constitués de récepteurs d'adhésion transmembranaires telles que claudines occludine, et des molécules d'adhésion jonctionnelle (JAM) qui s'engagent dans des homo-ou des interactions hétérophiles avec les récepteurs de la cellule voisine. Ils sont liés par voie intracellulaire des molécules d'échafaudage des zonula occludens (ZO) de la famille qui relient les récepteurs d'adhésion à cytosquelette d'actine de fournir un complément de résistance mécanique à l'épithélium. TJ sont responsables de tissu intestinal d'étanchéité à partir de la lumière intestinale, ce qui empêche l'excès d'eau et les fuites de soluté. Ainsi, après TJ sont perturbés par le parasite, les tissus sont envahis. E. histolytica sécrète plusieurs molécules telles que: (i) ceux qui sont impliqués dans l'adhésion des amibes à targET cellules 5; (Ii) les facteurs de membrane active qui participent à la destruction des cellules hôtes par exocytose, par exemple les peptides formant des canaux-ioniques appelés amoebapores 6,7; et (iii) des protéinases qui dégradent les protéines de la matrice extracellulaire et la médiation de tissu désintégration 5,8,9.
La cysteine protease EhCP112 et la molécule d'adhésion EhADH112 que forment ensemble le complexe EhCPADH112 sont deux E. histolytica virulence des protéines qui jouent un rôle majeur dans le démontage de TJ 10. Trophozoïtes vivants, de leurs lysats totaux et produits sécrétés induisent des changements moléculaires dans la perturbation complexe et fonctionnelle TJ de la barrière épithéliale. Dans cette étude, il est démontré que EhCP112 et EhADH112 interagissent avec occludine et la claudine-1 protéines menant à l'internalisation et la dégradation des protéines cellulaires, facilitant ainsi E. entrée de histolytica par la voie paracellulaire.
Nos données et celles of autres groupes 11-17 suggèrent fortement la nécessité des interactions hôte-pathogène spécifiques qui permettent l'invasion du parasite. Éclaircir la base moléculaire de ces interactions est d'une importance capitale pour une meilleure compréhension de la pathogenèse amibiase. Perturbation sélective de trophozoites en TJ, caractérisé par augmentation de la perméabilité paracellulaire, peut être mesurée par une diminution de la résistance électrique trans-épithéliale (TER). Le transfert des protéines parasitaires vers l'épithélium de l'hôte peut être déterminé par une coloration par immunofluorescence et microscopie confocale à balayage laser, une méthode qui peut également révéler la co-localisation des facteurs de virulence amibes avec des marqueurs épithéliaux jonctionnels indiquant des interactions directes possibles. Dans cet article, nous décrivons en détail comment les cellules épithéliales et les trophozoïtes sont cultivés, récoltés et manipulés pour examiner les interactions hôte-pathogène et leurs conséquences.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin d'étudier in vitro les interactions hôte-pathogène dans lors de l'infection par E. épithéliale histolytica, il est essentiel de travailler avec des cultures bien établies des deux cellules épithéliales et trophozoïtes. Par exemple, autrefois, E. cultures histolytica habituellement avaient été mis en place en association avec certaines espèces de bactéries ou trypanosomatidés 22,23. Cependant, la co-culture de E. cultures…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).
Materials
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/mL |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ mL |
| Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6 Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/mL |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/mL |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24 well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
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