Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano
Summary
Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.
Abstract
Trypanosoma brucei é um parasita que causa cinetoplastida tripanossomíase humana Africano (HAT), ou doença do sono, e uma doença debilitante, nagana, em bovinos 1. Os suplentes do parasita entre na corrente sanguínea do hospedeiro mamífero eo vetor mosca tsé-tsé. A composição de muitas organelas celulares muda em resposta a essas condições extracelulares diferentes 2-5.
Glicossomos peroxissomas são altamente especializados, em que muitas das enzimas envolvidas na glicólise estão compartimentados. Mudanças na composição glicossomo de uma forma de desenvolvimento e regulamentada ambientalmente 4-11. Atualmente, as técnicas mais comuns usadas para estudar glicossomo dinâmicas são microscopia eletrônica e de fluorescência; técnicas que são caros, tempo e mão de obra intensiva, e não é facilmente adaptada para análises de elevado rendimento.
Para superar essas limitações, um sistema repórter fluorescente glicossomo emo que aumentou a proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento de peroxissoma (PTS2), que dirige a proteína de fusão para glicossomos 12, foi estabelecido. Após a importação da proteína de fusão PTS2eYFP, glicossomos se tornar fluorescente. Degradação organelo e reciclagem resulta na perda de fluorescência que pode ser medido por citometria de fluxo. Um grande número de células (5000 células / seg) podem ser analisados em tempo real, sem grande preparação de amostras, tais como a fixação e montagem. Este método oferece uma maneira rápida de detectar mudanças na composição de organelas em resposta às variações das condições ambientais.
Introduction
Trypanosoma brucei causa a doença do sono Africano em seres humanos e uma doença debilitante, nagana, em bovinos. As drogas utilizadas no tratamento das referidas doenças são antiquado e extremamente tóxico, as vacinas não estão disponíveis, e o potencial para o desenvolvimento de resistência às drogas necessita da busca de novos alvos de medicamentos 1.
Durante seu ciclo de vida, T. brucei, alterna entre um inseto vetor e hospedeiro mamífero; dois hosts que se apresentam muito diferentes ambientes em que o parasita deve sobreviver. Uma série de alterações metabólicas e morfológicas ocorrer como o parasita está exposta a diferentes condições ambientais. Algumas das mudanças mais dramáticas são observadas em microcorpos específicas do parasita único delimitado por membrana, denominado glicossomos 13.
Os níveis de glicose são relativamente elevados (~ 5 mm) na corrente sanguínea e parasitas na corrente sanguínea (BSF) gerar ATP exclusivamente através wh glicólisemetabolismo mitocondrial ile é reprimida 14. Ao contrário de outros eucariotas, em que a glicólise ocorre no citoplasma, T. brucei compartimenta a maioria das enzimas glicolíticas em glicossomos 14,15. Os parasitas são absorvidos pela mosca tsé-tsé durante a farinha de sangue e experimentar uma queda em glicose, que cai para níveis indetectáveis dentro de 15 min de ser ingerido pela mosca. O metabolismo de inseto, forma procíclicos (PCF), parasitas é mais flexível e glicose, bem como aminoácidos, tais como prolina, pode ser usado na síntese de ATP 16-18. Estudos proteômicos comparativos revelam mudanças de ciclo de vida dependentes em glicosomal e proteínas mitocondriais com proteínas glicolíticas aumentou em parasitas na corrente sanguínea e proteínas mitocondriais envolvidos no ciclo TCA e cadeia respiratória 13,19. Enquanto muitos estudos têm-se centrado sobre as diferenças entre BSF e glicossomos PCF, pouco se sabe sobre as mudanças no glicossomos PCF que ocorrem em resposta aos envmudanças ironmental.
No intestino posterior da mosca, os níveis de glicose estão baixos com aumentos transitórios durante uma alimentação 20. Na maioria dos estudos in vitro, parasitas PCF são cultivadas em meios contendo glicose. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que mudanças no metabolismo PCF significativamente em resposta à glicose disponibilidade 17. Na ausência da glucose, a absorção de prolina e prolina aumento da actividade de desidrogenase 18. Esta mudança no metabolismo mitocondrial é provavelmente acompanhada por uma alteração na morfologia e composição glicossomo, no entanto, isto não foi avaliado directamente.
Electron e microscopia de fluorescência são técnicas comuns usadas para estudar a dinâmica glicossomo em T. brucei 2,21-24. Estes protocolos são o tempo e trabalho intensivo, caro e difícil de adaptar-se a estudos em tempo real e os protocolos de alto rendimento. Para superar esta limitação, um sistema repórter fluorescente organelo-used para estudar organelos em sistemas de mamífero e de levedura foi modificada para utilização em T. brucei 12.
Sistemas repórter fluorescente-organelas têm sido amplamente utilizados em eucariotos superiores, tais como fungos, plantas e células de mamíferos 25-27. Em tais sistemas, uma proteína fluorescente é fundido com uma sequência de aminoácidos que tem como alvo a proteína de organelos específicos. A degradação ou a síntese das proteínas-alvo é medida por meio de fluorescência e as mudanças na composição do organelo são reflectidas pelas alterações na fluorescência celular.
Quando a grelha de leitura aberta de maior proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento peroxissomal tipo II (PTS2) 12, a proteína é importado para PTS2eYFP, glicossomos maduros importação-competente e fluorescência podem ser monitorizadas por meio de citometria de fluxo. As variações na composição glicossomo são refletidas por mudanças na fluorescência celular. Este sistema pode auxiliar no resolVing os mecanismos que regulam as mudanças induzidas pelo ambiente em glicossomo composição.
Este manuscrito descreve a geração de um sistema repórter em glicossomo PCF parasitas em conjunção com citometria de fluxo para controlar a dinâmica glicossomo em tempo real em parasitas vivos e fornece um exemplo de como ele foi usado para seguir alterações na composição glicossomo em resposta a diferentes ambientes. Em resumo, glicossomo composição é influenciada pela concentração de glucose extracelular e a passagem de culturas em fase logarítmica em meio fresco provoca mudanças na composição glicossomo. Este sistema pode ser modificado para estudar o comportamento dinâmico de outros organelos nos tripanossomas e outros parasitas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glicossomos são, dinâmico, organelas essenciais específicos do parasita. Os processos que regulam a biogênese, manutenção, proliferação e remodelação dessas organelas provavelmente incluem alvos de medicamentos que poderiam ser exploradas para fins terapêuticos. Apesar do elevado potencial de abundância de tais alvos de drogas, o campo de glicossomo biogênese ficou para trás o estudo de processos similares em outros organismos, predominantemente, devido à falta de um sistema tratável, de alto rendimento …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.
Materials
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium Chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50X) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100X) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium Biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A.Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
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