肿瘤细胞球体的高通量图像分析：一个用户友好的软件应用来测量球体的大小自动准确

SpheroidSizer设计，生产自动化检测，划定和3D球体的测量，劳动和显着降低急性提高效率，大量的图像。 图1A显示SpheroidSizer的工作流程。核心计算步骤包括自动初始化，主动轮廓算法和轮廓量化。自动计算后，质量控制功能使用“手动初始化”和“手绘图”工具的组合来挽救任何不完美的分割。 图1B说明了详细的自动化的主动轮廓算法。在初始化步骤（第0次迭代）使用基本的图像处理步骤生成的旋转椭球体的近似大小和位置，并生成一个球形起始轮廓，估计大小。起始轮廓送入主动轮廓算法。反过来它遍历根据局部图像进行调整梯度和形状曲度。主动轮廓算法结束时的轮廓稳定（收敛）， 即 477次迭代为这个图象时，或者当执行迭代的预先定义的最大数。在这个例子中，初始化轮廓被故意放大，以更好地展示的算法。在现实中，在初始化通常是非常接近实际的边界并且需要少得多的迭代算法收敛。随后，该算法将检测到的球体边界的形态测量。球体的长轴和短轴采用MATLAB图像处理工具箱（ 图1C）测量。长轴被定义为线段连接的单个对轮廓，其被称为长度（L）上的最远点。短轴被定义为最长的线垂直于主轴线，其被称为宽度（W）。在这种情况下，L和W的值是由于非常接近球体是球形的。旋转椭圆体的体积计算为V = 0.5 * L * W 2。 其中SpheroidSizer的特点是它的自动化即使在不平或嘈杂的背景利用主动轮廓算法（ 图2B-D）图像的球体的边界检测。亮场图像计算处理往往是不均衡的背景下，这误导自适应阈值为基础的方法来产生不必要的阈值结果所困扰。这个问题是特别明显的，当多孔板的使用和井的壁可在其上创建图像的阴影效应。然而，因为主动轮廓算法不是在背景逐渐着色变化敏感，则能够确定在这些亮场图像与正确的初始化球体分割， 图2示出了具有不平坦的或有噪声的背景图像的几个例子，如不平照明（ 图2B </str翁>），碎片（ 图2C）或坏死核心（ 图2D）。用自动化的主动轮廓算法，SpheroidSizer描绘这些球状体准确地在所有这些图像所示的红色轮廓在每个图的下面板。 SpheroidSizer的质量控制功能的关键是一种高通量的工作流程。 “手动初始化”和“手绘图”工具是此应用程序的有价值的免费工具。其中数百幅图像或数千，这是无可避免的自动化算法是不能够正确地检测出球体的一些图片。 如图3A所示 ，当不当检测的旋转椭圆体因在初始化步骤引起的， 即不正确的尺寸或图像（上图）中的起始轮廓的位置，“手动初始化”工具的工作原理是使用户能够适当地定义spher的位置和大小手动OID（下图）。它触发的主动轮廓算法，主动与手动定义轮廓和执行收敛所需的轮廓。对于这些艰难的图像类似于图3B中的原始图像，球体位于一个分散和嘈杂的背景。 SpheroidSizer无法通过自动化的方法（上图）或“手动初始化”工具，正确的初始化（中间面板）正确识别的球体。在这种情况下，“手绘图”工具可用于手动绘制如图所示在下部面板的旋转椭球体的轮廓。该程序使用用户定义的边界来测量球体的长轴和短轴和计算量。所有的校正结果立即并入“结果表”，并可以相应地导出。 以确定SpheroidSizer在更大的数据集的性能，我们首先通过比较操作时间分析同一组使用1）手动测量显微镜供应商提供的软件288图像; 2）SpheroidSizer与单核笔记本电脑经常;和3）SpheroidSizer具有多核并行计算性能的工作站。手工测量请跟随我们的典型协议开发软件之前：每个球体的长度和宽度都是由手工绘制，并使用供应商的程序（如见图4A的顶部面板上的红色线）计量;然后用户拷贝下来测量的值。 SpheroidSizer通过产生的旋转椭球体的边界（如所示的红色轮廓在图4A中的下面板），测量轴向主要和次要的长度，并输出其结果在电子表格中处理每个图像。如表1所示，根据来自288的图像的计算，平均需要31.67秒手动测量每幅图像的球体;而只需要SpheroidSizer少于2秒＆ ＃160;在单核普通笔记本电脑上运行时;和小于1秒的12芯性能的工作站上运行时。因此，图像分析为每幅图像超过18倍更快的使用SpheroidSizer比手动测量。它极大地降低了劳动当超过数千张图片进行了分析。接着，我们的可变性，在图4A中所示的球状体24的手动测量和SpheroidSizer之间的测量值进行比较。该球状体24被测量三次通过两种方法;与每个单独的旋转椭球体的标准差的计算。就像在图4B中 ，从SpheroidSizer（绿线和量子点）的标准偏差是惟在质量控制步骤，它仍显示出比那些从手动测量方法较小的标准偏差校正三个球体接近于零。这些都表明SpheroidSizer更有效，更准确地进行图像分析。 e_content“>我们使用人类BON-1 3D肿瘤球体，以找出哪些化合物与HSP90抑制剂组合用于测试在体内的抗肿瘤作用的潜在候选人。人力BON-1 3D球体瘤生长进行药物筛选在如前面的纸张15中所述的琼脂糖包被的96孔板中。八种不同的化合物与6系列稀释液加媒体和车辆分别筛选其用10nM和在重复的20nM的HSP90抑制剂单一和组合的效果。两个球体分别用于单独的化合物或组合的化合物的各浓度。四个96孔板中，总384的球状体中使用，所有的球状体进行成像，在0，72，144，168，和192小时。总共1920图像制作从这个实验，花了SpheroidSizer仅30分钟即可完成1,920图像的计算分析与另外50分钟的质量控制和数据导出。SPHEROidSizer加快图像分析过程中的巨大。 图5A显示了一个屏幕截图的文件夹的安排和文件名 ​​这个实验作为协议步骤3.3一个例子。 图5B-E显示的图像分析弹出窗口和结果的屏幕截图。使用SpheroidSizer作为插图协议步骤4，5和7以三维球体的体积从格式化的结果表从SpheroidSizer出口，我们做了图表 – 在复合疗法的3D球体瘤生长与治疗时间。从这个实验中两个有代表性的图形示于图5F和5G。图5F显示了HSP90抑制剂和克拉屈滨（绿线）的组合治疗抑制的三维球状体以上的单一治疗HSP90抑制剂（紫线）或克拉屈滨（橙色线），这表明增长了HSP90抑制剂的联合治疗和克拉屈滨可能具有抗肿瘤EF体内 fects。 图5G显示了HSP90抑制剂和阿霉素（绿线）的组合疗法不抑制三维成长球状体以上的单一治疗阿霉素（橙色线）或HSP90抑制剂（紫线），这表明HSP90抑制剂和阿霉素的组合治疗方法可能不具有体内抗肿瘤效果。这个实验有助于我们更好地选择化合物，以测试其体内抗肿瘤作用和SpheroidSizer的关键是迅速实验数据分析。 表1人工测量和SpheroidSizer在分析同一组288的图像。之间的图像分析。手术时间比较 请Ç舔这里查看此表的放大版。 图1 SpheroidSizer – 。的主动轮廓算法用于测量球体的大小一个开放源代码的软件应用程序A）应用程序B中的核心工作流程）的插图在迭代中的不同阶段。请注意，初始化轮廓（迭代0）被故意放大，以展示该算法。C）的主要和次要的眼轴长度测量，并通过SpheroidSizer体积的计算。 L – 长轴：线段连接一对轮廓（简称长）的最远点; W – 短轴：最长的线垂直于主轴线（称为宽度）。 <p类=“jove_content”FO：保持together.within页=“总是”> 球体与坏死的核心图2。从SpheroidSizer的自动分割，表现出对各种图像条件下的鲁棒性代表性的结果。A）典型的图像质量好B）具有不同的亮度和对比度的图像。C）和分散注意力的碎片图像D）图片。在各图的顶部面板的图像是源/原始图像;在每个图的下面板的图像是质量控制的图像;而红色轮廓是由自动化计算得出的球体分割。 hres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg“/> 图3插图的“手动初始化”和“手绘图”工具。一）“手动初始化”工具使整个球体一个合适的椭圆形初始化的绘制，当不准确的球体分割的自动初始化后出现：B ）的“手绘图”工具可以让球体边界的准确手绘图，当不准确的球体分割发生自动和手动初始化。围绕球体的蓝线显示的初始化轮廓;红色轮廓是确定球体的边界。请注意，在“手动初始化”中A）和B中“手绘图”球体）椭球体是故意放大，以更好地展示工具。 <img alt="图4" fo:content宽度="“5英寸”FO：SRC" > 图4：在分析同一套24幅图像SpheroidSizer和手动测量之间的图像分析性能的比较。 A）代表性的球状体，以显示如何球状体的长度和宽度是由人工测量和SpheroidSizer确定。前24图像包含在使用手动测量红线每个球体的手绘长/宽;较低的24幅图像（同24幅图像）包含使用SpheroidSizer B）的长度或宽度从各个球体三次测量的标准偏差在红色轮廓的计算机绘制球体边界。 图5：利用球体的一个典型的例子粒度仪在药物筛选-从药物屏幕采用BON-1三维肿瘤球体A）屏幕截图的文件夹的安排和文件名 ​​这个项目B）屏幕截图先进的收集，该球体“图像的图像分析在SpheroidSizer C）的配置窗口的屏幕快照SpheroidSizer1.0窗口，并显示结果表。D）屏幕截图SpheroidSizer E）导出的格式输出文件的屏幕截图SpheroidSizer，F出口列表输出文件）后与HSP90抑制剂和克拉屈滨在与HSP90抑制剂和阿霉素的治疗肿瘤的三维球体。G）增长治疗肿瘤的三维球体生长。 请点击此处查看该图的放大版本。 </P>