Questo articolo fornisce un protocollo per l'estrazione di veleno da ragni con stimolazione elettrica al fine di 1) condurre la caratterizzazione proteomica, 2) stimolare veleno espressione genica della ghiandola, e 3) effettuare studi funzionali dei veleni. Questa è seguita da una descrizione di microdissections ghiandola veleno per studi di espressione genica.
Veleni sono chimicamente secrezioni complesse in genere composto da numerose proteine e peptidi con varie attività fisiologiche. Caratterizzazione funzionale di proteine del veleno ha importanti applicazioni biomediche, tra cui l'identificazione di cavi di droga o sonde per i recettori cellulari. I ragni sono la maggior parte delle specie ricca clade degli organismi velenosi, ma i veleni di solo poche specie sono ben compresi, in parte a causa della difficoltà associata a raccogliere quantità di veleno minute da piccoli animali. Questo articolo presenta un protocollo per la raccolta di veleno di ragni con stimolazione elettrica, deve dimostrare la procedura sulla vedova nera occidentale (Vedova nera). Il veleno raccolta è utile per varie analisi a valle, compresa l'identificazione diretta delle proteine tramite spettrometria di massa, saggi funzionali, e la stimolazione dell'espressione genica veleno per gli studi di trascrittomica. Questa tecnica ha il vantaggio rispetto protocolli che isotardi il veleno da intere omogenati delle ghiandole, che non separano i componenti originali veleno dalle proteine cellulari che non vengono secreti come parte del veleno. Rappresentante risultati dimostrano l'individuazione di noti peptidi del veleno del campione raccolto con la spettrometria di massa. La procedura di raccolta veleno è seguito da un protocollo per dissezione ghiandole velenifere ragno, con risultati dimostrano che questo porta alla caratterizzazione di proteine e peptidi-veleno espresso a livello di sequenza.
Veleni sono secrezioni animali prevalentemente iniettate in un altro animale a fini di predazione o di difesa, e hanno anche importanti applicazioni biologiche di rilevanza biomedica 1-3. Solo alcuni animali sintetizzano il veleno, ma la sua produzione è tassonomicamente diffusa in tutta invertebrati (ad esempio, cnidari, lumache cono, scorpioni e ragni) e vertebrati (ad esempio, i serpenti, alcuni pesci e mammiferi), perché si è evoluto in modo indipendente più volte 1,4 . Caratterizzazione biochimica di veleni mostrano tipicamente sono composti da un'ampia varietà di proteine e peptidi, che agiscono principalmente sul sistema circolatorio e nervoso di animali iniettati per fornire rapidamente tossine costituenti 1. Una piccola frazione di animali velenosi può costituire una minaccia per gli esseri umani, in particolare specie con distribuzioni sinantropici 5. Lo studio della composizione del veleno e le attività funzionali ha svolto un ruolo importante nellala caratterizzazione funzionale di componenti cellulari vertebrati (in particolare i canali ionici neuronali) 6 e nel chiarire processi cellulari fondamentali (ad esempio neurosecrezione) 7. Inoltre, selezionare i peptidi del veleno hanno proprietà utili in contesti biomediche, compresi i loro usi come trattamenti per il cancro e il dolore 8,9, e sono estratti per candidati cavi di droga e lo sviluppo antiveleno. Veleni anche svolgere un ruolo di primo piano nella ricerca ecologica ed evolutiva 1,4,10,11, quindi la raccolta di queste secrezioni pericolose ha molte utility.
Ci sono> 40.000 specie descritte di ragno (Ordine Araneae), e tutti, ma uno dei più di 100 famiglie in possesso di ragno coppie ghiandole velenifere che terminano in zanne 12. La diversità delle specie di ragni alto suggerisce che essi rappresentano la più grande clade degli organismi velenosi. Tuttavia, caratterizzazione biochimica di ragno veleni ha largely concentrata su un numero limitato di specie più spesso associati avvelenamento umano. Recenti studi di proteomica e trascrittomica di ragno veleni indicano che in genere contengono molte proteine e peptidi unici 2,13,14. I progressi nella high-throughput sequencing cDNA e spettrometria di massa peptide fingerprinting ha notevolmente facilitato la scoperta di queste proteine veleno 15. Tuttavia, tale lavoro ha inizio con la raccolta di veleno sufficiente e / o ghiandole velenifere dei ragni, e la documentazione dettagliata per tali tecniche sono pochi 16.
Questo articolo presenta un protocollo per la raccolta di veleno e veleno ghiandole di ragni vedova nera, che può essere applicato ai ragni di dimensioni simili. La collezione di veleno separatamente dalle ghiandole permette l'identificazione di proteine che sono secrete nel veleno al contrario di altre proteine che svolgono funzioni cellulari. Vedove nere ed altrospecie atrodectus sono ampiamente riconosciuti tra i ragni più pericolosi a causa della loro veleno altamente neurotossico, che causa un forte dolore negli esseri umani, che a volte è accompagnata da abbondante sudorazione, contrazioni muscolari, ipertensione, difficoltà respiratorie e paralisi chiazze 5. Il protocollo di raccolta veleno qui presentata utilizza elettro-stimolazione per fornire corrente elettrica ai ragni anestetizzati di suscitare contrazioni muscolari e il rilascio di veleno. Goccioline Venom sono rapidamente raccolti con micro-capillari e dispensati in provette per la conservazione congelatore. Dato che il protocollo prevede procedure pericolose, deve essere eseguito esclusivamente da personale ben addestrato e cautela è invitato a passaggi chiave. Il veleno raccolto ha numerosi usi, quali la caratterizzazione e l'isolamento di molecole costituenti 2, per gli esperimenti fisiologici o test funzionali 18, e per stimolare il veleno espressione genica 11. Il protocollo si conclude con una description della ghiandola del veleno dissezione e la conservazione utili per il clonaggio di geni specifici veleno, la cui espressione è stato verificato 2-3 giorni successivi veleno deplezione in diversi ragni 10,11.
Venoms rappresentano una fonte importante di proteine fisiologicamente reattivi, peptidi e altre molecole con applicazioni per la scoperta di farmaci, così come per gli aspetti fondamentali della ricerca cellulare e ecologica 1-3. Tuttavia, la raccolta di veleno, in particolare da animali pericolosi o di piccole dimensioni, è un compito impegnativo. Questo protocollo dimostra come veleno e veleno ghiandole possono essere raccolti da ragni vedova nera, e conferma il successo di questo approccio tramite una combinazione di analisi MudPIT del veleno e un database di proteine derivate da cDNA clonato da veleno di ghiandole 21. Anche se questo protocollo funziona bene per le vedove nere e ragni di medie dimensioni, altre tecniche di raccolta del veleno sono state impiegate per la più grande mygalomorph ragni (tarantola-simili), come ad esempio l'aspirazione diretta di veleno da denti in vetro pipette ad esempio, 24. Quest'ultimo approccio, tuttavia , non funziona bene per i ragni più piccoli di dimensioni che non sono aggressive.
Un aspetto particolarmente critico del protocollo di raccolta veleno qui descritto è la fase iniziale di preparazione e ottimizzazione del processo di raccolta in modo che diventi più di routine, coerente e veloce. Il protocollo è inizialmente difficile da padroneggiare, ma con prove ripetute, diventa più facile e più veloce. Cautela è inoltre invitata a tutte le fasi critiche che comportano la manipolazione di ragni pericolosi, l'uso di corrente elettrica, messa a punto in vetro micro capillari, e aghi da siringa. E 'importante indossare adeguati dispositivi di protezione individuale, come guanti di nitrile, un camice, pantaloni lunghi e scarpe chiuse, così come occhiali di protezione durante modellare micro capillari.
Un altro aspetto difficile da collezione veleno è la piccola quantità di veleno prodotto da qualsivoglia ragno, in particolare le specie Latrodectus, da cui gli importi raccolti possono essere litata a 1-2 microlitri per ogni individuo al meglio. Ottenere il veleno sufficiente per applicazioni a valle, come ad esempio gel di proteine o test funzionali può richiedere la combinazione di veleno da più individui in un tubo. In questi casi, il veleno dovrebbe essere combinato solo dagli individui dello stesso sesso, lo stadio ontogenetico, e la popolazione dato il riconoscimento di intersessuale, dello sviluppo e la variabilità geografica in alcuni veleni 25, 26. I ragni si possono presentare anche variare notevolmente la quantità di veleno prodotta tra gli individui, in cui importi inferiori può riflettere il recente esaurimento della ghiandola. Così può essere opportuno raccogliere veleno di alcuni giorni dopo la loro ultima poppata. Se poco veleno viene rilasciato, eccessiva corrente non deve applicare al ragno, che può causare la rottura della cuticola, portando alla contaminazione del veleno con emolinfa o la morte.
La contaminazione dei campioni di veleno con ragno SIfonti lk o umani dovrebbero essere evitati attraverso l'uso di materiale sterile o pulito. Nonostante queste sfide, la raccolta di veleno puro, lasciando vivo il ragno, è preferibile ai metodi che ottengono il veleno da omogenati delle ghiandole (che non separano i componenti del veleno da altre proteine cellulari) e uccidono il ragno. E 'anche fondamentale per garantire che i campioni siano rapidamente congelati per evitare la degradazione delle proteine.
L'estrazione di veleno promuove la successiva produzione di veleno, stimolando in tal modo l'espressione genica veleno nella ghiandola del veleno. Quindi, perché questo protocollo permette di ragni di sopravvivere veleno esaurimento, le loro ghiandole possono essere sezionati alcuni giorni dopo (uccidendo il ragno) in un punto in cui l'espressione del gene veleno dovrebbe essere sufficiente per gli studi genetici, come trascrizione clonazione 10,11. Diversi importanti precauzioni devono essere prese in dissezioni ghiandola del veleno. Occorre porre l'accento sull'utilizzo di laboratorio equipment e reagenti che sono privi di RNasi che degradano l'RNA. Pertanto si raccomanda di pulire pinze e altri materiali riutilizzabili e superfici con soluzioni che eliminano la contaminazione RNasi e DNA. Le dissezioni devono essere eseguite più rapidamente possibile e direttamente congelato per garantire ulteriormente l'integrità dell'RNA del tessuto. Infine, dissezioni devono essere eseguiti solo su ragni anestetizzati, dopo la loro cefalotorace e l'addome sono rapidamente separati.
In conclusione, questo articolo fornisce un protocollo di verifica per ottenere ragno veleno e veleno ghiandole. Venom e veleno ghiandole consentono l'isolamento e la caratterizzazione dei componenti proteici e peptidici mediante approcci di proteomica e trascrittomica. Inoltre, campioni veleno possono rappresentare il punto di partenza di saggi funzionali, che determinano il potenziale biomedico e farmacologico delle loro molecole costituenti. Quasi tutti i ragni producono il veleno, e l'ampia subacqueosità di componenti veleno sintetizzati da singole specie suggerisce una grande diversità di molecole di veleno sono ancora da scoprire 13. Di conseguenza, questo protocollo fornisce gli strumenti per studiare la ricca fonte di molecole biologicamente attive presenti in ragno veleni.
The authors have nothing to disclose.
Ringrazio le seguenti persone per la loro assistenza nello sviluppo di questo protocollo: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, e Mays Imad. Dati di spettrometria di massa e proteomica sono stati acquisiti dal Consorzio Arizona Proteomica supportato da NIEHS concessione ES06694 al SWEHSC, NIH / NCI concessione CA023074 al AZCC e dall'Istituto BIO5 della University of Arizona. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal National Institutes of Health (Istituto Nazionale di Medicina Generale) da sovvenzioni 1F32GM83661-01 e 1R15GM097714-01 a Jessica E. Garb.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |