מאמר זה מספק פרוטוקול להפקת ארס מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי כדי 1) לנהל אפיון proteomic, 2) ביטוי ארס גן הבלוטה לעורר, ו- 3) לבצע מחקרים תפקודיים של ארס. זה ואחריו תיאור של microdissections בלוטת ארס ללימודי ביטוי גנים.
ארס הם כימי הפרשות מורכבות בדרך כלל כוללות מספר רב של חלבונים ופפטידים עם פעילויות פיסיולוגיות מגוונות. אפיון פונקציונלי של חלבוני ארס יש יישומים ביו-רפואיים חשובים, לרבות זיהוי המקורות תרופתיים או בדיקות לקולטניות תאים. עכבישים הם clade העשיר ביותר המינים של יצורים ארסיים, אבל הארס של רק כמה מינים הם הבינו היטב, בין שאר בשל הקושי כרוך באיסוף כמויות זעירות של רעל מבעלי חיים קטנים. מאמר זה מציג פרוטוקול לאוסף של ארס מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי, הממחיש את ההליך על האלמנה השחורה המערבית (אלמנה השחורה). הארס שנאסף שימושי לניתוח במורד הזרם מגוון הכוללים זיהוי ישיר של חלבון באמצעות ספקטרומטר מסה, מבחני תפקודיים, וגירוי של ביטוי גני ארס ללימודי transcriptomic. טכניקה זו יש יתרון על פני פרוטוקולים שISOארס מאוחר מhomogenates בלוטה כולה, שאינו להפריד רכיבי ארס אמיתיים מחלבונים תאיים שאינם מופרשים כחלק מהארס. נציג תוצאות מדגימות את זיהוי של פפטידים ארס ידועים מהמדגם שנאסף באמצעות ספקטרומטר מסה. הליך גביית הארס ואחריו פרוטוקול לביתור בלוטות ארס עכביש, עם תוצאות מראות שזה מוביל לאפיון חלבונים הביעו ארס ופפטידים ברמת הרצף.
ארס הוא הפרשות בעלי חיים בעיקר הוזרקה לחיה אחרת למטרות טריפה או הגנה, וגם יישומים ביולוגיים חשובים עם הרלוונטיות ביו-רפואיות 1-3. רק בעלי חיים מסוימים לסנתז ארס, אבל הייצור שלה הוא טקסונומית נרחב על פני חסרי חוליות (לדוגמא, צורבים, חלזונות חרוט, עקרבים, עכבישים ו) ובעלי חוליות (לדוגמא, נחשים, דגים ויונקים), משום שהיא התפתחה באופן עצמאי מספר פעמים 1,4 . האפיון ביוכימי של ארס בדרך כלל להראות שהם מורכבים ממגוון רחב של חלבונים ופפטידים, הפועלים במידה רבה על מערכות דם ועצבים של בעלי חיים הזריקו כדי לספק במהירות רעלים המרכיבים 1. חלק קטן מבעלי החיים ארסיים עלול להוות איום על בני האדם, מינים במיוחד עם הפצות בקרבת האדם 5. המחקר של הרכב ארס ופעילויות פונקציונליות שיחק תפקיד חשוב בהאפיון הפונקציונלי של רכיבי חוליות סלולריים (במיוחד תעלות יונים עצביות) 6 והבהרת תהליכים בסיסיים סלולריים (לדוגמא neurosecretion) 7. יתר על כן, יש לי פפטידים ארס בחרו תכונות שימושיות בהקשרים ביו-רפואיים, הכוללים את השימושים שלהם כטיפול בסרטן וכאב 8,9, והם ממוקש למקורות תרופתיים מועמד ופיתוח חומר. ארס גם לשחק תפקיד מרכזי במחקר אקולוגי והאבולוציוני 1,4,10,11, ובכך האוסף של הפרשות מסוכנות אלה יש כלי עזר רבים.
יש> 40,000 מינים מתוארים של עכביש (להזמין Araneae), וכל אבל אחת משפחות העכביש יותר מ -100 להחזיק לזווג בלוטות ארס המסתיימות בניבים 12. מגוון המינים הגבוה של עכבישים עולה כי הם מייצגים את clade הגדול ביותר של יצורים ארסיים. עם זאת, אפיון ביוכימי של ארס של עכביש יש lמרוכז argely על מספר קטן של מינים לרוב משויכים envenomation האנושי. מחקרי proteomic וtranscriptomic האחרונים של ארס של עכביש לציין שהם בדרך כלל מכילים הרבה חלבונים ופפטידים 2,13,14 ייחודיים. התקדמות ברצף cDNA תפוקה גבוהה וטביעת אצבעות פפטיד ספקטרומטר המסה יש להקל באופן משמעותי את הגילוי של חלבוני ארס אלה 15. עם זאת, עבודה כזו מתחילה עם האוסף של ארס מספיק ו / או בלוטות ארס העכבישים, ותיעוד מפורט עבור טכניקות כגון מעט 16.
מאמר זה מציג פרוטוקול לאוסף של ארס ורעל בלוטות מעכבישי אלמנה שחורים, אשר יכול להיות מיושם על עכבישים בגודל דומה. האוסף של ארס בנפרד מהבלוטות מאפשר זיהוי של חלבונים שמופרשים לתוך הארס בניגוד לחלבונים מבצעים תפקידים סלולריים אחרים. אלמנות שחורות וL אחרמיני atrodectus מוכרים לציבור רחב כבקרב העכבישים המסוכנים ביותר בשל הארס שלהם הרעיל ביותר, אשר גורם לכאב עז בבני אדם, שלעתים מלווה בזעה מרובה, התכווצויות שרירים, יתר לחץ דם, קשיי נשימה ושיתוק בלתי סדיר 5. פרוטוקול אוסף הארס מוצג כאן משתמש אלקטרו-גירוי כדי לספק זרם חשמלי לעכבישים בהרדמה כדי לעורר התכווצויות ושחרורו של ארס שרירי. טיפות ארס נאספות במהירות עם מיקרו-נימים ולוותר לתוך צינורות לאחסון במקפיא. כי הפרוטוקול כרוך נהלים מסוכנים, זה צריך להתבצע רק על ידי אנשים מאומנים היטב וזהירות היא דחקה בשלבים עיקריים. יש הארס שנאסף רבים שימושים, כגון אפיון ובידוד של מולקולות המרכיבות את 2, לניסויים פיסיולוגיים או מבחני תפקודיים 18, וכדי לעורר ביטוי גני ארס 11. הפרוטוקול מסתיים בdescription של נתיחת בלוטת ארס ושימור שימושי לשיבוט של גני ארס ספציפי, הביטוי שהוכח להתרחש 2-3 ימים הבאים דלדול ארס בעכבישים שונים 10,11.
ארס מהווה מקור חשוב של חלבונים מבחינה פיזיולוגית תגובה, פפטידים ומולקולות אחרות בבקשות לגילוי תרופות, כמו גם להיבטים בסיסיים של מחקר סלולארי ואקולוגי 1-3. עם זאת, האוסף של ארס, במיוחד מבעלי חיים מסוכנים או קטנים, היא משימה מאתגרת. פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן לאסוף בלוטות ארס ורעל מעכבישי אלמנה שחורות, ומאשר את ההצלחה של גישה זו באמצעות שילוב של ניתוח MuDPIT של הארס ומסד נתוני חלבון נגזרים מcDNAs המשובטים מארס בלוטות 21. בעוד פרוטוקול זה עובד היטב עבור אלמנות שחורות ועכבישים בגודל בינוניים, טכניקות אוסף ארס אחרות הייתם מועסקות במשך mygalomorph גדול עכבישים (כמו טרנטולה-), כגון שאיפה ישירה של ארס מניבים לתוך כוס טפטפות לדוגמא, 24. גישה זו אחרונה, עם זאת , לא יעבוד היטב עבור עכבישים קטנים יותר בגודל שאינם aggressive.
היבט אחד קריטי במיוחד של פרוטוקול אוסף ארס המתואר כאן הוא בשלבים הראשונים של הכנה ואופטימיזציה של תהליך האיסוף, כך שהוא הופך להיות יותר שיגרתי, עקבי ומהיר יותר. הפרוטוקול הוא בהתחלה מאתגר להורים, אבל עם ניסויים חוזרים ונשנים, הוא הופך להיות קל יותר ומהיר יותר. זהירות גם דחקה בו בכל השלבים הקריטיים מעורבים בטיפול בעכבישים מסוכנים, השימוש בזרם חשמלי, מיקרו נימי זכוכית עדין נקודה, ומחטים מזרק. חשוב ללבוש ציוד מגן אישי מתאים כגון כפפות nitrile, חלוק מעבדה, מכנסיים ארוכים ונעליים סגורות, כמו גם משקפי שמש, כאשר עיצוב נימי מיקרו.
עוד היבט מאתגר לאוסף ארס הוא הכמות הקטנה של ארס מיוצרת על ידי כל עכביש אחד, במיוחד מינים אלמנו, שממנה הסכומים שגבו יכול להיות ליmited ל1-2 מיקרוליטר לנפש, במקרה הטוב. קבלת ארס מספיק עבור יישומים במורד הזרם, כגון ג'לים חלבון או מבחני תפקודיים עשויה לדרוש שילוב של ארס מאנשים מרובים לתוך צינור אחד. במקרים כאלה, ארס צריך להיות משולב רק מאנשים מאותו המין, השלב האונטוגנטי, ואוכלוסייה נתון הכרה בשונות intersexual, התפתחותי וגיאוגרפיות בחלק הארס 25, 26. עכבישים יכולים גם להפגין הבדלים ניכרים בכמות הארס שהופקה בין אנשים, שבו כמויות פחותות עשויות לשקף הדלדול האחרון של הבלוטה. כך זה עשוי להיות כדאי לאסוף כמה ימי ארס לאחר ההאכלה האחרונה שלהם. אם ארס קטן משתחרר, נוכחי מוגזם לא צריך להחיל את העכביש, שעלולה לגרום לציפורן להתפקע, יגרום לזיהום של הארס עם hemolymph או מוות.
זיהום של דגימות ארס עם si העכבישיש להימנע גם ממקורות LK או אדם באמצעות השימוש בציוד סטרילי או נקי. למרות האתגרים הללו, אוסף של ארס טהור, שעזב את העכביש בחיים, עדיף על שיטות שלקבל ארס מhomogenates בלוטה (שאינו להפריד רכיבי ארס מחלבונים תאיים אחרים) ולהרוג את העכביש. כמו כן, חשוב להבטיח כי דגימות מוקפאות במהירות כדי למנוע פירוק חלבונים.
הפקת הארס מקדמת ייצור ארס שלאחר מכן, ובכך מגרה ביטוי גני ארס בבלוטת הארס. כמה ימים כך, מכיוון שפרוטוקול זה מאפשר לעכבישים כדי לשרוד דלדול ארס, עלולות להיות גזורים הבלוטות שלהם מאוחר יותר (הריגת העכביש) בנקודה שבה ביטוי גני הארס צפוי להיות מספיק למחקרים גנטיים, כגון תמליל שיבוט 10,11. כמה אמצעי זהירות חשובות גם יש לקחת בניתוחי בלוטת ארס. יש לשים דגש על שימוש במעבדת מכשירים וציודאף אוזן גרון וריאגנטים כי הם ללא RNases שלו פוגע בRNA. כך מומלץ לנגב מלקחיים וציוד שאינו חד פעמי אחר ומשטחים עם פתרונות שלחסל זיהום RNase ו- DNA. הניתוחים צריכים להתבצע במהירות אפשרית ובאופן ישיר הקפוא כדי להבטיח את שלמות RNA של הרקמות נוספות. לבסוף, יש לבצע ניתוחים רק על עכבישים מורדמים, לאחר cephalothorax והבטן שלהם מופרדים במהירות.
לסיכום, מאמר זה מספק פרוטוקול מאומת להשיג בלוטות ארס עכביש וארס. בלוטות ארס והרעל לאפשר לבידוד והאפיון של מרכיבי החלבון ופפטיד תוך שימוש בגישות proteomic וtranscriptomic. בנוסף, דגימות ארס יכולות לייצג את הנקודה של מבחני תפקודיים, הקובעים את הפוטנציאל ביו-רפואי והתרופתי של מולקולות המרכיבות אותן מתחילה. כמעט כל העכבישים מייצרים ארס, והצוללן הרחבעיר עתיקה של רכיבי ארס מסונתזים על ידי מינים בודדים מציעה מגוון עצום של מולקולות ארס הם עדיין לא גילו 13. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מספק כלים כדי לחקור את המקור העשיר של מולקולות פעילות ביולוגית קיימים בארס עכביש.
The authors have nothing to disclose.
אני מודה לאנשים הבאים על עזרת בפיתוח של פרוטוקול זה: צ'אק Kristensen, גרטה Binford, אלכס ק 'לנקסטר, קונרד Zinsmaier, ומייז עימאד. נתונים ספקטרומטריית ופרוטאומיקה המוניות נרכשו על ידי פרוטאומיקה Consortium אריזונה נתמכת על ידי ES06694 מענק NIEHS לSWEHSC, CA023074 מענק NIH / NCI לAZCC ועל ידי מכון BIO5 מאוניברסיטת אריזונה. מימון עבור עבודה זו סופק מהמכון הלאומי לבריאות (המכון הלאומי לרפואה כללית) ממענקים 1F32GM83661-01 ו1R15GM097714-01 לג'סיקה א גארב.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |