開発の初期段階での切開およびゼブラフィンチ胚のダウンストリーム解析

倫理声明：メソッドはウィリアム＆メアリーカレッジの繁殖コロニーから家畜化キンカチョウを行った。すべての手順は、RSPCAのガイドライン23に続き、ウィリアム·アンド·メアリーOLAW（実験動物福祉事務所）動物福祉保証（＃のA3713-01）の大学によって承認されたと（＃2013から06施設内動物管理使用委員会（IACUC）の承認を持っていた – 02から8721 – dacris）。 1。卵の収集とインキュベーション暗サイクル：午後02時10光にキンカチョウのペアを確立します。食料、水、干し草、および巣箱を自由に指定してください。注意：キンカチョウのための日常のお手入れや繁殖がうまく23を説明してきた。 傾斜棚標準ひよこインキュベーターを準備します。注：37.5にて人工インキュベータを維持日常的に培養器の底部に水を添加することによって、湿度95％ – – 80°C（+ / 1）。インキュベーターは、2日間平衡化させ使用する前に。 インキュベーター内で卵を保持するために、少なくとも2.5 cm深い、小さなフィードカップ（5×7.6センチメートル）を選択します。ボトムライン、ペーパータオルの二つの層を有するカップの下縁まだ卵が容易に転動させながらカップは、パディングされるようにする。インキュベーターの傾斜棚にこれらのカップを置きます。注意：あまりにも多くのパディングがローリングを抑制することができ、原因シェル内部に胚の接着に成功したインキュベーションを防ぐであろう。 光サイクルの開始後2時間で卵を収集します。注意：これは親のインキュベーションのために与えられたインキュベーション時間のための段階の開発の矛盾を最小限に抑えます。 卵の長さに沿った先端部と基部の親指と人差し指で軽く卵を拾う。巣から集め敷設日付と時刻にラベルを付けるために鈍い、柔らかい4Bグラファイト鉛筆を使用してください。注記：より柔らかい4Bの鉛筆が壊れやすい卵の殻を破っ鉛筆のリスクを低減します。 各Cで5ラベルの卵 – 1.3.2）1を配置しますインキュベーター内で卵は自由にシェルの内部に胚付着を防止することができるように、ロールアップ。注：カップに5つ以上の卵を配置すると、個々の卵の転がりを防止し、胚の生存率を減少させることができる。 卵から胚の2。取り外し解剖の準備をするには、以下の資料を揃えます。きれいなメスで、細かい傾いて鉗子、および2極細先端鉗子を。 10×10センチの切開のためにきれいな、非吸収性の表面を提供するために、解剖スコープのベースに、紙の重さに配置します。注：卵黄の容易な操作を可能にし、メスで繊細な膜をカットするための最良の面であるため、秤量紙が非常に重要です。 を50mlポリプロピレンチューブリン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）のアリコートを調製し、少なくとも3つの転送ピペットおよび小さな廃バケットを取得する。胚を固定する場合は、4％パラホルムアルデヒド（PFA）のアリコートを調製注意：PFA蒸気は毒性で、D PFAを含むすべてのステップは、露出を最小限にするためにヒュームフード内で行われるべきである。 Flashは胚を凍結した場合、液体窒素を取得し、解剖スコープの近くに保管してください。無菌性は、この解剖プロトコルの問題ではなく、すべての材料が汚れていないことを確認してください。 キンカチョウステージングガイド22で説明したように所望の段階に必要な時点でインキュベーターから卵を取り出します。注：22 12胚（ 図3A）の段階を分析するために、ステージ6の胚（ 図4A）22 を分析し、インキュベーションの56時間後に卵を除去するために、インキュベーションの36時間後に卵を削除します。 光ファイバー照明ランプを用いて、内部を照明するために、卵を介してその縦軸に沿って光輝き、それを保持することによって卵ロウソク。卵の背後にある光の先を置き、卵黄と発生中の胚を見つけます。 卵黄反対側にメスを置き、端から端まで卵に沿って切断かすかな圧力でベース。 慎重に親指と人差し指で卵の先端とベースに圧力を加えて卵の内容を削除するか、優しく鉗子で切断とともに卵殻を離れて詮索好きなことで。卵黄を優しくロールアウトするよう直接秤量紙の上に卵を開きます。 胚発生を囲むかすかな白い輪のように見えている、接合部の白いゾーンの卵黄を調べ、胚中心に位置するように極細先端鉗子を使用して卵黄を向けます。 注意：卵黄の表面にかすかな白い円が認められていない場合は、細かい鉗子を取り、優しく胚は卵黄の上になるまで、卵黄をロールオーバーする。注意：ステージ1 – 9 22、胚性ディスクは、直径が6mm未満であると卵黄の表面にかすかな、わずかに不透明ディスクとして表示されている-の基準については図1を参照してください。ステージ10歳以上の22のために、血液プールは、改善されたVを許可胚のisibilityが、これは困難な胚を見つけますように、卵黄嚢を穿刺しないように注意してください。 胚体外組織からの胚の3。分離圧力（ 図1B）を緩和するために卵黄の端を穿刺し、胚のディスクと一緒に卵黄の直径の長さにわたって単一のカットを行います。胚を含有する卵黄の断面が正常（ 図1B）によって分離されるまで、これらの対角線を繰り返し行う。注：この手順は卵黄質量がそのまま残ることを可能にするが、胚中心に切断する際に卵黄の表面に減圧は、より精度を可能にし、胚の構造への損傷を防止する。 ホールピペットと卵黄のエッジを削除します。注：可能な限り卵黄を削除したが、胚が秤量紙と涙の乾いた表面に付着しないように、少量のままにしておきます。 ディスペンサーによる胚ディスクを洗う胚の底部に向かって45°の角度で1×PBSをING。隣にはなく、上記の胚のディスク転送ピペットの先端を置きます。付加的な卵黄を除去する必要がある場合は、ペトリ皿に胚を転送する前に、秤量紙の上で外科用メスを有する任意の卵黄を分離する。注意：この方法は、秤量紙の表面から胚を削除します。 小さなプラスチック製のペトリ皿に1×PBSの最小容量と一緒にホールピペットを用いて、胚を転送します。直接ではなく、胚、上に、シャーレにより1×PBSを加えて、近くに1×PBSを滴下して胚を洗浄します。洗って除去残留卵黄を、ペトリ皿を傾けて、ホールピペットで廃棄物1×PBSを除去するためのペトリ皿を旋回。 NOTE：1X PBSが除去されると、プラスチック表面が残留1X PBSで滑りやすいので、胚が典型的にペトリ皿の底に付着しない。胚は皿に付着した場合は、より多くの1X PBSを添加することができる。 Tを固定した場合彼は、胚、ステップ3.5および3.6に従ってください。フラッシュ胚を凍結した場合は、すぐに3.8に進みます。 in situハイブリダイゼーションのための胚を固定した場合は、すぐに胚を沈めるためにペトリ皿に4％PFAを追加。それを平らにするために、胚の上に直接、4％PFAを垂らし;これはカール胚を防ぐことができます。 12時間4℃で4％PFA中で胚を固定します。 固定後、100パーセントMeOH中、-20℃で段階的メタノール（MeOH）ソリューション、店舗内の胚を脱水。 胚はステージ1の間にある場合- 8 22、胚に付着した卵黄膜を除去します。注：このステップは、固定中または後に行うことができる。彼らは卵黄膜に付着ので、ステージ8 22歳未満の胚を簡単に図2（a）に示すように、キー構造が不明瞭に、可視化されていません。 グリップ極細ピンセットとの接合部の区域を越えて延びている膜のエッジ。 Carefully残留卵黄顆粒を洗い流すと卵黄膜に胚ディスクの付着を緩めるために、複数回にわたって胚を反転させます。注：これは、胚の構造を損傷するように、胚の中心に手を触れないでください。 ギャップジャンクショ​​ンのゾーンと卵黄膜との間で表示されない場合は、ゆっくりと卵黄膜からそれを緩めるために極細先端の鉗子との接合部の区域を傷つける。グリップ極細と卵黄膜は、鉗子を傾け、ゆっくりと離れて胚から引き​​出します。必要に応じて、ゆっくりと接合部の帯に胚ディスクの周縁部を把持して離れて卵黄膜から胚を引き出します。 除去した後に、バイオハザード1廃棄物（バイオセーフティレベル1）中の卵黄膜を捨てる。 若い胚のステージ上のISHアッセイを行う場合には、ニワトリ胚24、25のための標準的なホールマウントISHのプロトコルに従いますが、以下の提案を考慮してください。 <ol> ISH手順中の胚への損傷を低減するために、各胚のためのねじキャップで単一の5mlガラスバイアルを使用する。胚が完全に水没していることを確認して、溶液3ml – わずか2でバイアルを埋める。旋回装置に固定されている発泡スチロールラック（またはセキュアバイアルを保持する任意のラック）に5ミリリットルバイアルを配置することによって垂直方向に章動バイアル。注意：この予防措置は、水平ニューテーション時にバイアル瓶の蓋に接触したときに発生する可能性のある、引き裂かれるの胚を防ぐことができます。 胚のステージ0の場合は- 6 22、室温で5分間1X PTwは5μg/ mlのプロテイナーゼKで処理する。バックグラウンド染色を減少させるために10 37℃で10分間1X PTwは内​​μg/ mlのプロテイナーゼKで12 22 -治療胚は7を上演した。 12時間、10μg/ mlのプローブ濃度と共にインキュベート、10 22 -段階1中の遺伝子発現の低いレベルを検出するために十分な呈色反応を生成する。古い段階のために、1＆＃でインキュベート956; 60℃でグラム/ mlのプローブ濃度解剖次のペトリ皿に3ミリリットル1X PBSおよび卵黄顆粒から胚を分離するシャーレを傾け – フラッシュ凍結胚は、すぐに2を追加した場合。液体を除去し、2繰り返す – すべての卵黄を削除するには3回。細かい使用すると、-80℃で保存する前に予め標識マイクロチューブと液体窒素中でフラッシュ凍結に鉗子、移植胚をひっくり返した 4。のEdU細胞増殖アッセイ。定款とゼブラフィンチ胚におけるのEdUの検出。 胚または卵黄を検索する光ファイバー照明ランプを用いて卵キャンドル。 胚をマイクロインジェクションプロセス中に損傷を受けないことを確実にする卵内の胚又は卵黄の場所にマーク卵の反対側。 ライン粘土と60ミリメートルのプラスチック皿所望の向きに卵を保持するために、ボウルの形状でそれを金型。マークされたスポットは、あるべきマイクロマニピュレーターを用いてマイクロインジェクション針の挿入を可能にするように方向付け。注：粘土は、マイクロインジェクションの間に、ステップ4.11でのインキュベーションを通して卵を安定します。 2ガラスキャピラリーマイクロインジェクション針を引き出します。マークされたスポットで卵に穴を突くために1針を鈍ら。鉱物油とそれをバックロードとマイクロインジェクターに挿入して注入のための第二のマイクロインジェクションの針を準備します。 マイクロインジェクターで59.8 NLに注射あたりに放出溶液の容量を設定します。 10 mMストックのEdU溶液によるマイクロインジェクション針をロードします。 卵の空洞にシェルのシェルまたはドロップ部分を粉々にしないように注意しながら、鈍化ガラスキャピラリーでマークされたその場で殻に穴を作成します。オリエント卵穴マイクロインジェクション針が卵黄または胚に空洞を介して直接挿入することができるように、45°の角度になるように。 マイクロマニピュレーターを用いて、挿入ロード針キャビティへ約1.0センチメートル。 直接胚や卵黄にEdUの液の所望の量を注入する。注：EdUを478 nlの最大は、胚の死を生じることなく注入することができる。 すぐに卵とインキュベーション中の胚の乾燥を防ぐために料理をカバーするためにラップの複数の層で卵と粘土ホルダーをラップします。インキュベーション中アンラップからプラスチックを防ぐために、皿の底にプラスチックラップの端をテープで固定します。注意：プラスチック製のラップは解剖直前に削除する必要があります。 所望の段階に到達するまで、新たに増殖している細胞は、37℃でインキュベートすることによって卵のEdUを組み込むことを可能にする。注入後、培養器内の棚を傾けるに卵を返しません。インキュベーターの内側で安定した面のプラスチック包装された粘土並ぶ料理を置きます。 プラスチック製のラップを外し、前述のプロトコルに従って、胚を解剖。4％PFA中で胚を固定し、上記のように、4℃で12時間インキュベートする。固定後、さらなる分析まで-20℃で新鮮な100％EtOH中で5分間、店舗100％のエタノール（EtOH）で洗浄する。 5。のEdUは、反応プロトコル」をクリックして " 以下のステップは、すべてのガラスバイアル中で行われる。 次の連続5分間の洗浄で胚を再水和： エタノール、75％エタノールおよび25％滅菌脱イオン25％EtOHおよび75％1X PTwは、100％1X PTW、（SDD）水、50％エタノールと50％のSDDの蒸留水 10分ごとに100パーセント1X PTwは中3回洗浄する。 水（90μlの）は、SDD 9部に10×緩衝原液（10μL）の1部分を組み合わせることにより、反応緩衝液添加剤（キットの部品F）を希釈します。 次を混合することにより、別のチューブ中の反応ミックスを調製する：875μlの1×PBS、20μLのCuSO 4、5μL、アジ、希釈し100μlの反応緩衝添加剤。注：反応混合物の容積は縮小することができる。胚が完全に反応混合物に覆われている場合は、反応が動作します。使用直前に希釈された反応バッファー添加剤（ステップ5.3）を追加します。全ての後続ステップは暗所で行われる。光から保護するために、ホイルで胚をカバーしています。 アルミホイルでバイアルを覆い、かつニューテーターに取り付けられたスタイロフォームのラックに入れて、2時間室温で垂直にインキュベートする。 10分ごとに新鮮な1×PBS中で胚を3回洗浄します。 4℃で一晩新鮮な4％PFA中で胚を培養する 4℃で新鮮な1×PBS中で10分間ずつ、ストア用に1×PBSで3回洗浄するさらなる分析までホイルで胚をカバーしています。