JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Номера хроматографической очистки рекомбинантного Эластин-подобных полипептидов и их слияний с пептидов и белков с<em> Кишечная палочка</em

Published: June 09, 2014
doi:
10.3791/51583
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University, 2Research Triangle MRSEC,Duke University

Summary

Эластин-подобные полипептиды стимулирования проблематику биополимеры с приложениями, начиная от рекомбинантного очистки белков к поставке наркотиков. Этот протокол описывает Очистка и характеристика эластина, как полипептидов и их пептид или белок слияния из кишечной палочки, используя их ниже критического поведения фазового перехода температура раствора в виде простой альтернативы хроматографии.

Abstract

Эластин-подобные полипептиды повторяющиеся биополимеры, которые проявляют более низкую критическую поведение фазового перехода температура раствора, существующих в виде растворимых unimers ниже характерной температуры перехода и агрегирования в микронных коацерватами выше их температуры перехода. Конструкция эластина, как полипептиды на генетическом уровне позволяет точно контролировать их последовательности и длины, который диктует свои тепловые свойства. Эластин-подобные полипептиды используются в различных областях применения, включая биодатчиков, тканевой инженерии и доставки лекарств, где температура перехода и биополимер архитектура ELP могут быть настроены для конкретного применения, представляющего интерес. Кроме того, нижняя критическая фаза температура раствора переход поведение эластина, как полипептидов позволяет их очистки по их термической реакции, так что их селективное коацервация и resolubilization позволяет удаление как растворимые и нерастворимые примесис следующее выражение в кишечной палочки. Этот подход может быть использован для очистки отдельно или в виде инструмента для очистки пептидов или пептидных гибридов, где рекомбинантные пептиды или белки генетически прилагаемые к эластина, как теги полипептид может быть очищен без хроматографии эластина, как полипептидов. Этот протокол описывает очистку эластина, как полипептидов и их пептид или белок слияния и обсуждает основные методы определения характеристик для оценки тепловой поведение чистых эластина, как полипептидных продуктов.

Introduction

Эластин подобные полипептиды (ELPS) биополимеры, состоящие из повторяющейся пентапептида VPGXG где X, гость остаток, является любой аминокислотой, кроме пролина. ELPS демонстрируют более низкую критическую температуру решение (LCST) фазовое поведение переход, таким образом, что нулевое решение ELP будет разделяться на две фазы при нагревании до его LCST, который обычно называют температура перехода обратная (Т т) в литературе ELP 1. Две фазы состоит из очень разбавленной фазе ELP глобулы и ELP фазы, обогащенной осадка. ELP богатый осадок формируется на короткий промежуток времени после агрегации цепей ELP в микронного размера частиц, которые впоследствии сливаются. Это происходит в диапазоне нескольких градусов Цельсия и обычно обратимым, так как гомогенный раствор извлекают после возвращения в температуре ниже T T.

ELPS обычно синтезируется в кишечной палочки (E.coli) сюдам искусственный ген, который лигируют в плазмиду экспрессии. Эту плазмиду затем превращается в E. палочка линия клеток, что является оптимальным для экспрессии белка. Мы использовали исключительно векторную систему T7-Lac ПЭТ экспрессии большого разнообразия ELPS в Е. палочка, хотя другие системы экспрессии в дрожжах 2-4 грибов 5 и растений 6-8, также были использованы другими исследователями. Ряд подходов существуют генетически построить повторяющиеся гены ELP, в том числе рекурсивного направленного перевязки (RDL) 9 рекурсивного направленного лигирования по плазмиды реконструкции (Pre-RDL) 10, и перекрывают расширения качению усиление круг (OERCA) 11. Возможность инженер ELPS на генетическом уровне дает возможность использовать технологии рекомбинантной ДНК, чтобы создать ELPS с различными архитектурами (к примеру, моноблоки, диблоков, Триблоки, и т.д.), которые могут быть дополнительно добавленным с функциональнойпептиды и белки. Контроль на генетическом уровне также гарантирует, что каждый ELP выражается с точным длины и состава, продиктованной его генетического шаблона плазмиды, обеспечивая идеально монодисперсных продукты биополимерных.

Термические свойства каждого ELP зависеть от параметров, присущих биополимера, такого как его молекулярной массы (MW) и последовательности, а также внешних факторов, включая его концентрации в растворе и при наличии других cosolutes, такие как соли. Длина ELP 12 и его состав гостевой Остаток 1, 13, 14 две ортогональные параметры в ELP конструкции, которые можно использовать для управления T T, где гидрофобные остатки гостей и более длинные цепи приводит к снижению Т Т S, в то время как гидрофильный гостей остатки и короткие отрезки цепи приведет к повышению Т Т S. Концентрация ELP обратно пропорциональна Т Т, где решений грКонцентрация едок ELP имеют более низкие Т Т S 12. Тип и концентрация солей также влияют на ELP T T, где влияние солей следует за серию Hofmeister 15. Космотропных анионы (Cl – и выше на серии Гофмейстера) снизить ELP T T и повышение концентрации соли усиливает этот эффект. Эти внутренние и внешние параметры могут быть настроены, чтобы получить температурный режим в диапазоне температур целевой, необходимого для конкретного применения в ELP.

Стимул аспекты поведение ELPS полезен для разнообразных применений, включая биодатчиков 16, 17, 18 тканевой инженерии и доставки лекарств 19, 20. Кроме того, при ELPS сливают с пептидами или белками на генетическом уровне, ELP может служить простой очистки тега, чтобы обеспечить недорогой метод пакетного для очистки рекомбинантного PEPприливы или белки, которые не требует хроматографии 21. Модификация процесса очистки гарантирует, что активность пептида или белка, слитого с ELP сохраняется. Пептида или белка слияния ELP могут быть очищены для применений, в которых тег ELP является полезным 22, 23 или, альтернативно, когда свободный пептид или белок необходим, сайт, распознаваемый протеазой могут быть вставлены между пептида или белка и ELP. Удаление тега ELP затем может быть достигнуто путем гидролиза свободного протеазы или протеазы ELP синтеза, где последний обеспечивает дополнительный легкость обработки в качестве конечного этапа очистки ELP может отделить ELP тегов и протеазы ELP сплав из целевого пептида или белок в одну стадию 24, 25. Следующий протокол описывает процедуру очистки для ELPS и пептид или белок ELP слияний с помощью своих тепловых свойств и обсуждает основные методы для характеристикитепловая реакция продуктов ELP.

Protocol

1. ELP Выражение Привить 3 мл стерильной СМИ Потрясающе Бульон с ДМСО или агар пластины колонии E. палочка подходит для экспрессии белка, который содержит нужную ELP-плазмидой, кодирующей под контролем T7-Lac промотора. Добавить соответствующий антибиотик и инкубировать при 37 ° С в течение ночи (O / N) с непрерывным перемешиванием при 200 оборотах в минуту. Добавьте 1 мл культуры O / N до 1 л Потрясающий Бульон стерильных сред в 4-литровую колбу. Добавить соответствующий антибиотик и инкубировать при 37 ° С в течение 24 часов с непрерывным перемешиванием при 200 оборотах в минуту. Примечание: "течь" базовый выражение увидеть с Т7-Lac промотора является достаточным для высокого уровня экспрессии многих ELPS если культуру инкубируют в течение 24 часов. Однако, более традиционный подход может быть использован, в котором экспрессия белка дополнительно индуцировали добавлением 0,2-1 мМ изопропил-бета-D-тиогалактозида (IPTG), когда оптическая плотность культуры достигает 0,6. </li> Передача культуру от 4-литровую колбу на 1 л, центрифуги бутылки и центрифуге при 4 ° С в течение 15 мин при 2000 х г. Удалите супернатант. ПРИМЕЧАНИЕ: Если более 1 л культуры выращивают их можно конденсируется, добавив еще один литр культуры к осадку и повторив шаг 1,3. До 2 л культуры может быть сжата в одной гранулы клеток. Ресуспендируют гранул в фосфатном буферном растворе (PBS), воды или другого требуемого буфера для достижения 45 мл суспензии клеток и передачи в 50 мл коническую пробирку. 2 ELP очистки:. Предварительные шаги и Первый раунд обратного перехода на велосипеде Разрушать ультразвуком ресуспендировали осадок клеток в общей сложности 9 мин в циклах 10 сек 'на' и 20 сек 'Off' в выходной мощностью 85 Вт, в то время выдержки образца на льду. Вкратце образец позволяют охлаждаться на льду и затем повторить цикл 9 мин еще раз. ПРИМЕЧАНИЕ: Если ELP, как ожидается, имеют очень низкую T T </суб> 'от' интервал может быть увеличен до 40 сек, чтобы избежать нагрева выше Т т раствора. Передача лизата до 50 мл с круглым дном центрифужную пробирку. Добавляют 2 мл 10% (вес / объем) полиэтиленимин (PEI) на каждый литр культуры и встряхнуть, чтобы перемешать. ПРИМЕЧАНИЕ: PEI представляет собой положительно заряженный полимер, который помогает в конденсации отрицательно заряженных генетических примесей. Не выполняйте этот шаг, если ELP заряжен отрицательно, так как PEI может конденсироваться и удалить продукт ELP. Центрифуга при 4 ° С в течение 10 мин при 16000 х г. Передача супернатант в чистую 50 мл с круглым дном трубки центрифуги и отбросить осадок. Дополнительный "испечь из" шаг: Выдержите образец при 60 ° С в течение 10 мин для денатурации белковых загрязняющих примесей, а затем передать до 4 ° С или в лед, пока ELP не будет полностью ресолюбилизировали. Центрифуга образца при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 16000 х г. Перенести супернатант в клEAN 50 мл с круглым дном центрифужные пробирки и отказаться от осадка. ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте этот шаг, если пептид или белок слит с ELP, и ожидается, для денатурации в состоянии повышенной тепло. Это может вызвать переход ELP стать термически необратимый или могут разрушить активность конденсированного фрагмента. Вызвать переход ELP с добавлением кристаллического NaCl (не более 3 м). Кроме того, цитрат натрия (не выше 0,3 м) может быть использован для ELPS, которые имеют более высокую Т Т S или низкие выходы. ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен мутнеть, как только соль растворится, что указывает на фазовое разделение ELP из раствора. Очень гидрофильные ELPS с высокой Т Т S может потребовать определенную степень нагрева в сочетании с добавлением соли, чтобы вызвать фазовое разделение ELP в этой предварительной индукции перехода ELP. Центрифуга при комнатной temperatue (RT) в течение 10 мин при 16 000 мкг (горячая спина). ПРИМЕЧАНИЕ: ELP гранул должны бэ наблюдается, размер которого зависит от доходности экспрессии ELP. Это осадок ELP может показаться на первый взгляд непрозрачным, но после охлаждения он появится полупрозрачная и может быть коричневого цвета. ELP осадок станет более бесцветным, как очистка продолжается и загрязнения удаляются. Жидкость над осадком сливают и добавляют 1-5 мл желаемого буфера в таблетки. Ресуспендируют гранул с помощью пипетки или установки трубки вращаться при 4 ° С. Примечание: Требуемый объем буфера будет зависеть от размера гранул ELP, и таким образом выход ELP выражением, где достаточное количество буфера должно быть добавлено, чтобы обеспечить resolubilization гранулы ELP. ELPS с пользой высокое содержание цистеина от очистки в воде с 10 мМ Трис гидрохлорид (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР-HCl) при рН 7, чтобы исключить взаимодействие с дисульфидные загрязняющих белков. ELPS с выгодой высокое содержание заряд от очистки при рН доводили до нейтрализовать их заряд и уменьшить Electrostatic взаимодействия с загрязняющих белков. Передача ресуспендировали решение ELP в 1 мл аликвоты в чистые 1,5 мл микропробирок. Центрифуга при 4 ° С в течение 10 мин при 16 000 мкг (холодный отжим). Небольшой осадок нерастворимых примесей необходимо соблюдать. Передача супернатант в чистую пробирку и отбросить гранул. . 3 ELP Очистка: последующих раундах обратный переход на велосипеде Вызвать переход ELP с тепла и / или добавлением NaCl. Образцы могут быть инкубировали на нагревательный блок или на водяной бане в течение 15 мин при температуре выше T T. Однако, если ELP слит с белком (исключающее использование тепла) или если ELP обладает высокой T T, которые не могут быть достигнуты с теплом в одиночку, в 5 М раствора NaCl можно каплям добавляли, чтобы побудить ELP переход. ПРИМЕЧАНИЕ: Решение должно мутнеть, указывая фазовое разделение ELP из раствора. <li> Центрифуга течение 10 мин при 16 000 мкг (горячая спина). Если тепло использовали на стадии 3.1, выполнения этой стадии центрифугирования при температуре выше той, которая требуется, чтобы вызвать переход ELP. Если один NaCl использовали на стадии 3.1, выполнения этой стадии центрифугирования при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ: следует соблюдать ELP осадок. Жидкость над осадком сливают, добавляют 500-750 мкл желаемого буфера и вновь суспендируют таблетку с помощью пипетки или установки трубки вращаться при 4 ° С. Центрифуга при 4 ° С в течение 10 мин при 16 000 мкг (холодный отжим). Небольшой осадок нерастворимых примесей необходимо соблюдать. Передача супернатант в чистую пробирку и отбросить гранул. Повторите шаги от 3,1 до 3,5, пока не загрязнителем осадок не наблюдается во время этапа 3.4. 4. Обработка после очистки (опционально) При желании диализировать образца против подходящем буфере, чтобы удалить избыток соли из очищенного раствора ELP. ПРИМЕЧАНИЕ: ELPS быть лиофилизованные должно бытьдиализу против DDH 2 ОО / N при 4 ° С. При желании лиофилизацией ELP для длительного хранения при замораживании раствора при -80 ° С в течение 30 мин до лиофилизации O / N. Примечание: лиофилизации не должны использоваться для ELPS с прилагаемой белков. При желании восстановить свободный пептид или белок из пептида или белка слияния ELP, удалив тег ELP: Дайджест пептид или белок ELP слияние с биотинилированным протеазы (как, рекомендованной поставщиком протеазы) или с протеазы ELP слияния, соответствующей сайте протеазы генетически разработан между пептида или белка и ELP. Если возможно, удалите биотинилированный протеазы помощью стрептавидин-модифицированный бусы (в соответствии с рекомендациями поставщика протеазы). Вызвать переход скола ELP и / или протеазы ELP слияния по каплям добавляют раствор 5 М NaCl. Центрифуга при комнатной температуре в течение 10 мин при 16000 х г. ПРИМЕЧАНИЕ: следует соблюдать ELP осадок. Сбор супернатант и отбросить осадок ELP. Диализировать супернатант от желаемого буфера или использовать центробежный фильтр, чтобы выполнить обмен буфера с тем, чтобы удалить высокую концентрацию соли от чистого пептида или белкового раствора. Подтверждение полное расщепление свободного пептида или белка из тега ELP по додецилсульфата натрия электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). 5 Характеристика:. SDS-PAGE Подготовка образцов для ELP SDS-PAGE путем смешивания 10 мкл ELP разбавленные в воде с 10 мкл образца буфера, содержащего 2-меркаптоэтанол. Примечание: 40 мкг ELP часто бывает достаточно, чтобы оценить размер и чистоту продукта ELP. Инкубируйте образца при 100 ° С в течение 2 мин, а затем загрузить на полиакриламидном геле вместе с соответствующего размера белка лестнице. Запуск гель при 180 V, пока краситель не приблизится к дна геля (примерно 45 мин). Пятногель с 0,5 М раствора CuCl 2 в течение 5 мин, в то время качания. ПРИМЕЧАНИЕ: ELPS, как правило, не визуализировали кумасси бриллиантовым голубым красителем, так как некоторые последовательности ELP не взаимодействуют с этим красителем. Кумасси бриллиантовый синий взаимодействует в первую очередь с остатков аргинина и слабо взаимодействует с другими основными остатками-гистидин и лизин-и ароматическими остатками-триптофан, тирозин, и фенилаланина 26. Таким образом ELPS и пептид или белок слияния ELP может быть окрашивали кумасси бриллиантовым голубым, только если их основной последовательность включает достаточное количество этих конкретных остатков. Убедитесь, что MW группы ELP соответствует теоретической МВт, ожидаемого от гена ELP и что никакие посторонние загрязняющие полосы нет. ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые ELPS мигрировать с кажущейся МВт до 20% выше, чем ожидаемое МВт 9, 27. 6 Описание:. Матрица-лазерной десорбцией /ионизации Время-пролетный масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) Подготовка раствора ELP в 50%-ного водного ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, чтобы достичь концентрации ELP примерно 25 мкм. Примечание: Этот раствор должен быть свободен от соли, так ELP должны быть диализовали против H 2 O следующее очистки. Подготовьте матрицу насыщенный раствор sinapinic кислоты в 50%-ного водного ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты. Добавить 1 мкл раствора ELP к 9 мкл матричного решения для достижения концентрации ELP приблизительно 2,5 пмоль / мкл. Примечание: Эта смесь может быть дополнительно разбавляли матричного раствора, чтобы оптимизировать сигнал MALDI-TOF. Депозит 1-2 мкл ELP-матрицы смеси на металлическую MALDI пластины и пусть пятно полностью высохнуть. Получить 5-10 спектры с MALDI-TOF для определения массы к заряду (m / z) из ELP и определить его измеренное МВт. 7. Characterizatioн: Температура-Турбидиметрия и динамического рассеяния света Определите T т ПЕЛ по температурно-программируемой турбидиметрии: Подготовить ряд разбавления (например, от 5-100 мкм) решений ELP в нужном буфере. Использование контролируемой температурой UV-VIS спектрофотометр, измеряют оптическую плотность (OD) при 350 нм в течение диапазоне температур (например, 20-80 ° С) со скоростью нагрева 1 ° С / мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Если ни увеличение OD не видел Т т может превышать верхнего предела температуры прибора. Кажущаяся T т может быть уменьшена путем добавления NaCl. Начало в 1 М NaCl и увеличивать с шагом 0,5 м до перехода ELP не обнаружен в измеримом диапазоне температур. Проверка обратимость перехода ELP путем измерения снижения OD в том же диапазоне температур при скорости охлаждения 1 ° С / мин. Определите T т гомополимер ELP путем определения точки перегиба профиля мутности (OD нанесены в зависимости от температуры). Примечание: Эта температура может быть легко определяется из производной кривой OD, где температура, соответствующая максимуму производной определяется как T T. Более сложные архитектуры ELP покажет более сложные профили мутности и должна быть дополнительно анализировали, как описано в разделе 7.2. Дополнительная характеристика ELPS, которые отображают более сложные тепловые свойства (например, ELP диблок-сополимеры, которые самостоятельно собираться в сферические мицеллы) достигается за счет динамического рассеяния света (DLS): Подготовка раствора ELP в желаемом буфере и передавать образца через фильтр с размером пор 20-450 нм. ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор фильтра размером пор будет зависеть от присутствия, размера и стабильности любых ELP сборок в растворе. Наименьший возможный размер пор фильтра является предпочтительным для удаления примесей, таких какпыль, что ухудшит качество измерений DLS. Большее фильтр размер пор должен использоваться, когда значительное сопротивление переживается при прохождении раствора ELP через меньших размеров пор фильтра. Измерить гидродинамический радиус (R H) в диапазоне температур, который соответствует области, представляющей интерес, определенных в профиле мутности. ПРИМЕЧАНИЕ: ELP unimers обычно имеют R H <10 нм, ансамблей наночастиц иметь R H ~ 20-100 нм, и агрегаты имеют R H> 500 нм. Каждый увеличение R H должно соответствовать увеличению ОП при 350 нм, измеренного UV-VIS спектрофотометрии в зависимости от температуры, которая пропорциональна размеру частицы.

Representative Results

Здесь мы опишем репрезентативные результаты для очистки и характеристики на гомополимер ELP и диблоксополимера ELP. После 24 ч выражения в E. палочка, клетки собирали центрифугированием и лизировали с помощью ультразвука. Как правило, тонкое изменение в цвете происходит после обработки ультразвуком, подтверждающие достаточное лизис клеток (рис. 1А). После добавления PEI, геномные компоненты и продукты распада клеток собирают центрифугированием, отделяя большой осадок нерастворимых загрязняющих веществ из растворимого ELP в надосадочной жидкости (рис. 1В). ELP дополнительно очищают обратный переход на велосипеде (ITC), которая эксплуатирует поведение НКТР отделить ELP от обоих растворимых и нерастворимых примесей (рис. 2) 28. Фазовый переход ELP инициируется добавлением тепла и / или соли. Результаты центрифугирование приводит к образованию гранул в нижней части трубки, который состоит из ELP ай некоторые нерастворимые примеси (рис. 1в). Этот шаг-называется горячие спин-отбрасывает растворимые загрязнения в супернатанте а осадок ELP сохраняется и ресуспендировали в холодном буфере. Солюбилизировали ELP снова центрифугировали при 4 ° С. Этот шаг-называется холодные спин-отбрасывает гранул нерастворимых примесей, а супернатант, содержащий растворимый ELP сохраняется. Повторить цикл чередования холодных и горячих спины увеличивает чистоту ПЕЛ, но за счет несколько снижается урожайность, а остаточная ELP теряется при каждом ITC туре в центрифужные пробирки и на наконечники пипеток. Успешное очистка ELPS и пептид или белок слияния ELP подтверждается SDS-PAGE. Малые аликвоты, принимаемые в течение всего процесса очистки демонстрируют прогрессирующее очистку ELP от Е. палочка лизат. ELP сверхэкспрессируется в сырой Е. палочка лизат и загрязняющие вещества уменьшают остроумиеч последовательные раунды МТЦ (рис. 3). Очищенная ELP появляется в виде одной полосы вблизи прогнозируемого теоретической МВт. ELP Т т характеризуется температурно-программируемой турбидиметрии. Мутность профиль из гомополимера ELP демонстрирует один резкое увеличение OD при 350 нм (приблизительно 2,0 единицы выше базовой линии для концентрации ELP 25 мкм) (рис. 4, а). Охлаждение мутности сканирует подтвердить обратимый характер перехода ELP как ОП возвращается к первоначальным, когда температура опускается ниже T T (рис. 4В). Диблок-сополимеры ELP демонстрируют более сложный профиль мутности по сравнению с гомополимера ELPS. OD обычно сначала возрастает до 0,1-0,5 единиц выше базового, после чего OD резко возрастает до 2,0 единиц выше базовой линии (рис. 5А). DLS измерения предоставлять информацию об изменении в R H относительно температуры, со rroborating информацию получил из профиля мутности (рис. 5б). Рисунок 1. Предварительная очистка ELP. Через 24 часа после выражения, E. палочка клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в PBS. A) Клетки лизировали обработкой ультразвуком, которое сопровождается тонким изменением цвета такой, что лизат темнеет после ультразвуком. б) после того ПЭИ конденсироваться загрязняющие вещества ДНК, лизат центрифугировали и большой осадок нерастворимого мусора отделена от растворимого ELP в супернатант. С) Переход ELP индуцируется с добавлением тепла и / или соли и центрифугирования форм полупрозрачный ELP гранул.АНК "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Обратный переход на велосипеде. ELP очищают с помощью его LCST поведения от растворимых и нерастворимых примесей. Начиная с ELP-богатой лизата (1) переход ELP индуцируется с добавлением тепла и / или соли и ELP отделяют центрифугированием (горячая спина) (2). ELP осадок сохраняется (3а), а надосадочную жидкость, содержащую растворимые загрязнения отбрасывается (3b). ELP ресуспендируют в холодном буфере (4) и снова центрифугировали при 4 ° С (холодный отжим) (5). Осадок, содержащий нерастворимые загрязнители отбрасывается (6а), а супернатант, содержащий растворимую ELP сохраняется (6b). Циклы переменного горячие и холодные спины повторяются, пока нужная чистота не будет достигнуто, как это определено сSDS-PAGE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. Анализ с помощью ДСН-ПААГ ELP продуктов очистки. Успешное очистка из ELP подтверждается SDS-PAGE. Сверхэкспрессируется ELP проявляется в сырой Е. палочка лизат после обработки ультразвуком (2). После добавления PEI и центрифугирования растворимый ELP в основном сохраняется в супернатанте (3), хотя некоторые ELP теряется в отбрасывали гранул нерастворимых загрязнений (4). Супернатант после первого горячего спина содержит значительные уровни растворимых загрязняющих веществ (5). Супернатант после первой холодной спина указывает на хорошее разделение ELP от нерастворимых загрязняющих веществ (6). Дополнительные циклы горячей (7) и сстарый спинов (8) удаления остаточных растворимых и нерастворимых загрязнений, соответственно, пока окончательные горячие (9) и холодной спиновые (10) супернатанты не проявляют посторонние загрязняющих полос, подтверждающие удовлетворительное чистоту продукта ELP. Это ELP гомополимер, с последовательностью SKGPG-(VGVPG) 80-Y, имеет ожидаемый молекулярный вес 33,37 кДа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4. Характеристика ELP гомополимера по температурно-программируемой турбидиметрии. ELP T т определяется путем мониторинга оптической плотности при 350 нм при увеличении температуры со скоростью 1 ° С / мин. A) ELP гомополимеры демонстрируют один резкое увеличение в OD, что определениеИнес их Т т при данной концентрации. B) обратимость перехода ELP проверяется путем мониторинга ОП при 350 нм раствора 25 μ М при снижении температуры, где обратимость подтверждается возвращения ОД к базовой линии. Это гомополимер ELP имеет последовательность SKGPG-(VGVPG) 80-Y. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5. Характеристика ELP диблоксополимера по температурно-программируемой турбидиметрии и динамического рассеяния света. ELPS, которые подвергаются нано-самосборки, такие как ELP диблочных сополимеров, что самостоятельно собираться в сферические мицеллы, выставочная более сложных профилей мутности. <stronг>) Умеренный рост OD указывает на переход от unimers к мицеллы, перед быстрым увеличением ОП, который указывает полный агрегацию ПЕЛ в микронных агрегатов. B) DLS измерения подтверждают поведение, выведенную из профиля мутности для Решение 25 мкм путем предоставления информации об изменении в R H по температуре. Здесь unimer ELP имеет R H ~ 8 нм и мицеллы имеет R H ~ 25 нм. Это диблоксополимер ELP имеет последовательность GCGWPG-(VGVPG) 60 – (AGVPGGGVPG) 30-PGGS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

ELPS предлагают недорогой и хроматографии без средств очистки эксплуатации их фазового поведения стимула проблематику. Этот подход использует преимущества поведения НКТР ELPS и пептид или белок ELP слияний устранить как растворимые, так и нерастворимые загрязнители после экспрессии генетически кодируемых ELPS в Е. палочка. Эта простота очистки может быть использована для производства ELPS для различных применений, или могут быть использованы для очистки рекомбинантных пептидов или белков, в которых ELP может выступать в качестве тега очистки, которые могут быть удалены с обработкой после очистки.

Очистка ELP включает предварительные шаги, чтобы лизировать E. палочка и удалить геномной и нерастворимый мусор клеток из сырой культурной лизата (рис. 1), с последующим удалением остаточных растворимых и нерастворимых примесей МИАНЗ (рис. 2). Центрифугирования после срабатывания перехода ELP по дополции тепла или соли отделяет ELP из растворимых примесей в надосадочной жидкости на этапе называется горячей вращение. После resolubilizing в ELP, раствор снова центрифугируют при температуре ниже T T, чтобы удалить нерастворимый осадок загрязнений на этапе называется холодный отжим. Переменный горячие и холодные спины улучшает чистоту раствора ELP с каждым циклом, за небольшую плату, получая. Выходы очистки варьироваться в зависимости от ELP T T, длины и слитых пептидов или белков. Как правило, этот протокол дает 100 мг очищенного ELP на литр Е. палочка культуры, однако урожайность может достигать до 500 мг / л Окончательный чистота продукта ELP подтверждается SDS-PAGE (рис. 3). MW очищенного ELP должен соответствовать в тесном контакте с теоретической МВт, кодируемого геном ELP. Тем не менее, некоторые ELPS мигрировать в SDS-PAGE с кажущейся МВт до 20% выше, чем ожидаемое МВт 9, 27. Более точный анализ ПЕЛМВт может быть достигнуто путем MALDI-TOF-MS, который также может обеспечить дополнительную информацию о чистоте продукта ELP вместе с ортогональным аналитических методов, таких как высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

После очистки ELP T т измеряется температурно-программируемой турбидиметрии. Этот метод контролирует ОП раствора ELP то время как температура увеличивается. Т т зависит от концентрации, поэтому мы рекомендуем, чтобы охарактеризовать концентрационный ряд относящуюся к прямому применению ELP. Для ELP гомополимеры профиль мутность демонстрирует одну резкое увеличение что соответствует переходу от ELP unimer в микронных агрегатов (фиг.4А). Т т определяется как температуры, соответствующей точке перегиба в профиле мутности, точно определяется как максимум первой производной OD по отношению к температуре. ОбратимостьФазовый переход ELP подтверждается уменьшением ОД до исходного как при понижении температуры ниже T T (рис. 4В). Профиль мутности с увеличением и уменьшением температуры пандусы будут отличаться по величине и кинетики из-за оседания ELP коацерватами и переменной гистерезиса ELP resolubilization. Пептида или белка слияния ELP так же демонстрируют поведение НКТР таким образом, где пептид или белок, слитый с ELP влияет на T T. Для белка слияния ELP переход обратим ниже температуры плавления белка. В то время как температура запрограммированных турбидиметрия является отличным способом для начальной тепловой характеристике продуктов ELP, альтернативных методов, таких как дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), также может быть использован для измерения ELP T T.

ELPS с более сложными архитектурами экспонат более сложных тепловых поведения, которые также можно охарактеризовать температурной программе?MMed турбидиметрия. Диблок-сополимеры ELP, например, демонстрируют характерный профиль, соответствующий мутности температуры срабатывает самосборки их в сферических мицелл в их критической температуры мицеллообразования. Для таких диблоксополимеров ELP ОП обычно сначала увеличивает 0,1-0,5 единиц выше базовой линии, указывающие на переход от unimers к мицеллы, после чего резкое увеличение OD (до 2,0 единицы выше исходного уровня) при более высокой температуре указывает на образование микронного масштаба агрегаты (рис. 5, а). Дополнительная информация о температурных-срабатывает самоорганизующихся ELP структур получается с DLS, техника, которая измеряет R ч ELP сборок в растворе. Изменения в R H согласуются с изменениями в ОД, измеренных с турбидиметрии (рис. 5б). ELP unimers обычно имеют R H <10 нм в то время как наночастицы сборки проявляют R H ~ 20-100 нм и агрегатов проявляют R H </suб >> 500 нм. Дополнительная информация о самоорганизующихся ELP наночастиц, таких как числа агрегации и морфологии, может быть получено статического рассеяния света или криогенной просвечивающей электронной микроскопии 17, 23, 29.

Благодаря Перестраиваемость ELP тепловых свойств, диапазон Т Т S получается различных конструкций ELP. Важно иметь в виду, что присуще Т т повлияет на оптимизацию схемы очистки для каждого ELP, где крайне низкий или высокий Т Т S потребует большую модификацию этого стандартного протокола. ELPS с чрезвычайно высокими температурами перехода, могут не подходить для очистки с этим подходом. Если конструкция новых ELPS и пептид или белок ELP слияния может поставить под угрозу тепловой отклик ELP, простой гистидин тега может входить альтернативной очистки иммобилизованным металлоаффинной хроматографии. Кроме того,характеристики последовательности ELP может потребовать модификации этого протокола, если гость остаток взимается. Манипуляции с буфером, рН может быть использован в качестве метода для изменения общее руководство ПЕЛ в попытке устранить электростатические взаимодействия с загрязнителей 17. Кроме того, этот протокол подходит для специальной обстоятельства ELP слияния с пептидов и белков, когда соответствующие меры, чтобы в процессе очистки не возмущает деятельность конденсированного фрагмента. Примечания по всему протокола о таких модификаций служат для направления очищение ELPS, которые могут представить эти проблемы по отношению к T T, заряда, или заботами синтеза.

Очистку ELPS посредством их поведение НКТР представляет собой простой и хроматографии свободной подход, чтобы очистить большинство ELPS и пептид или белок слияния ELP экспрессируется в E. палочка. Протокол кратко здесь позволяет очистки Oе ELPS в течение одного дня, используя оборудование, которое является общим для большинства биологических лабораториях. Легкость очистки ELPS и их гибридов, как мы надеемся, поощрять постоянно растущее разнообразие ELP конструкций для новых приложений в области материаловедения, биотехнологии и медицины.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана в ННФ Research Triangle MRSEC (DMR-1121107).

Materials

pET-24a(+)
pET-25b(+)		 Novagen 69749-3
69753-3		 T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).
Ultra BL21 (DE3) competent cells Edge BioSystems 45363 Competent E. coli for recombinant protein expression.
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media MO BIO Laboratories 12105 Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.
Phosphate buffered saline (PBS) tablet Calbiochem 524650 These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C.
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) MP Biomedicals 195444 PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL Thermo Scientific 3138-0050 These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) Thermo Scientific 20491 A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.
Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl Bio-Rad Laboratories 161-1105 These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.
Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O) Fisher Scientific C454-500 A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.
Anotop 10 syringe filter:
0.02 μm
0.1 μm
0.2 μm		 Whatman 6809-1002
6809-1012
6809-1022		 These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.
Millex-HV filter:
0.45 μm		 EMD Millipore SLHVX13NK These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Urry, D. W. Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers. J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).
  2. Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris. Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).
  3. Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).
  4. Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris. Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).
  5. Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).
  6. Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants. Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).
  7. Conrad, U., et al. ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).
  8. Kaldis, A., et al. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures. Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).
  9. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).
  10. McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes. Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).
  11. Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of ‘smart’ protein polymers. Nat Mater. 10, 141-148 (2011).
  12. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).
  13. Urry, D. W., et al. Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity. Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).
  14. Urry, D. W. The change in Gibbs free energy for hydrophobic association – Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions. Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).
  15. Cho, Y., et al. Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides. The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).
  16. Kim, B., Chilkoti, A. Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding. J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).
  17. Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).
  18. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).
  19. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers. Biopolymers. 94, 60-77 (2010).
  20. McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).
  21. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. , (2010).
  22. Shamji, M. F., et al. Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic. Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).
  23. Hassouneh, W., et al. Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers. Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).
  24. Lan, D. M., et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).
  25. Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides. Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).
  26. Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
  27. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).
  28. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).
  29. McDaniel, J. R., et al. Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation. Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).

Tags

Elastin-like PolypeptidesRecombinantNon-chromatographic PurificationLower Critical Solution TemperaturePhase TransitionCoacervationEscherichia ColiPeptide FusionProtein FusionBiosensingDrug DeliveryThermal Properties

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. J. Vis. Exp. (88), e51583, doi:10.3791/51583 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image