JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

ניתוח Phosphopeptide של מכרסמים epididymal תאים-זרע

Published: December 30, 2014
doi:
10.3791/51546
, , ,
1School of Environmental and Life Science,University of Newcastle, 2Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences,Monash University

Summary

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Abstract

תאים-זרע הם די ייחודיים בין סוגי תאים. למרות שמיוצרים באשכים, שני שעתוק הגנים הגרעיני והתרגום כבויים פעם התא העגול מראש הסמן מתחיל להאריך ולהתמיין למה שהכיר מורפולוגית כתא זרע. עם זאת, תא הזרע הוא מאוד לא בוגר, שאין לו יכולת לתנועתיות או הכרת ביצה. שני האירועים הללו מתרחשים ברגע מעבר תאי זרע איבר משניים הידוע ביותרת האשך. במהלך מעבר היום ~ 12 שלוקח לתא זרע לעבור יותרת האשך, לאחר translational שינויים של חלבונים קיימים לשחק תפקיד מרכזי בהבשלה של התאים. היבט מרכזי אחד כזה הוא זרחון חלבון. כדי לאפיין אירועי זירחון התרחשו במהלך התבגרות זרע, שתי אוכלוסיות תאי זרע טהורות וטרום-חלוקה של phosphopeptides יש לקבוע. באמצעות גב טכניקות שטיפה, שיטה לבידודה של o תאי זרע הטהורהאיכות גבוהה f ותשואה מepididymides דיסטלי או הזנב מתוארת. הצעדים לsolubilization, עיכול, וטרום-חלוקה של phosphopeptides הזרע דרך Tio 2 כרומטוגרפיה זיקה מוסברות. ברגע בודד, ניתן להזריק לתוך phosphopeptides MS לזהות שני אירועי זירחון החלבון על שאריות חומצת אמינו מסוימות ולכמת את הרמות של מקום זירחון לוקח במהלך תהליכי התבגרות הזרע.

Introduction

לאחר שיצא מהאשך, תאים-זרע הם מאוד מובחנים עדיין להפליא, תאים אלה הם לא בוגרים 1,2. ככזה, אין להם פונקציונליות מלאה, כולל היכולת לשחות ונקשר לביצית 3. למרות שנדרשה התבגרות נוספת של תא הזרע, זה לא יכול להתקיים באמצעות מסלולים הקנונית, שכן בשלב זה של תהליך התמיינות התאים שלהם, הם לא מסוגלים שעתוק הגנים וחלבונים נוספים ביוסינתזה 4. היכולת ביולוגית המוקנה תאי זרע שהם עוזבים את האשך והזן חלק ממערכת הרבייה של הגבר הידוע ביותרת האשך 5. יותרת האשך הוא צינור בחוזקה מפותל, מובחן מאוד שמחבר את צינורות efferent (של האשך) לצינור הזרע וקיים בכל יונקי זכרי 6. תאי זרע בהדרגה לרכוש פוטנציאל דישונם במהלך ירידת epididymal, בהסתמך על סביבת luminal המשתנה שהוא created על ידי תאי האפיתל epididymal המקומיים 7. פעילויות הקליטה מחדש הפרשה והשונות הנמצאות בסביבת המעשה epididymal לשנות את הזרע עצמו, שינוי הרכב חלבונים, הפחמימות ושומנים בדם שלה 6. החשיבות של יותרת האשך, במיוחד באזור הראשוני 'Caput' של מבנה זה כבר באה לידי ביטוי באמצעות טכניקות קשירה כירורגית 8. תאים-זרע נשמרים בתוך האשך על ידי קשירת צינור efferent הם לחלוטין חסרים כל יכולת להפרות את הביצית 9-11.

בנוסף לסביבת epididymal, מסלולי העברת אותות תוך עבודת תאי הזרע כדי שלאחר translationally לשנות את ההשלמה תא זרע הקיימת. לדוגמא, תאים-זרע מהאזורים המוקדמים של יותרת האשך להציג דפוסים שונים של זירחון חלבון בהשוואה לאזורים אלה האחרונים 5,12. הדבר אינו מפתיע שכן יש הבדלים עצומים בגapability של הזרע מאזורים אלה. לדוגמא, תאים-זרע מהמוקדם, Caput יותרת האשך הם immotilite. בניגוד לכך, תאי זרע מאזור cauda יעברו קדימה תנועתיות מתקדמת להציב פעם אחת במדיום איזוטוני. מאחר ותאי זרע epididymal אינם מסוגלים סינתזת חלבון דה-נובו, כל המסלולים הפנימיים המסדירים את תפקוד זרע חייבים להיות הדרך לאחר translational שינויים (PTM). מכאן, זה מתקבל על הדעת שפרוטאומיקה, ובפרט החקירה של PTMs כגון זרחון חייבת להיות דחף גדול אם ברצוננו להבין התבגרות תא זרע.

שיטה חלופית להשגת תאי זרע מepididymidies להשתמש רטרו-backflushing 13-16. למרות שטכניקה זו היא בהחלט זמן רב יותר ולוקחת מידה רבה יותר של מיומנות על ידי המפעיל, התאים-הזרע המתקבלים בעקביות להפגין טוהר העולה על 99.99%. בנוסף, בניגוד לכל הטכניקות האחרות, ca תאים-הזרעn להיות מבודד במצב שקט, מה שמאפשר ללמוד כיצד תנועתיות זרע היא יזמה. כהכנת מדגם הוא ההיבט החשוב ביותר לניתוח proteomic, בידוד של תאי זרע הפך לאחד ההיבטים החשובים ביותר של מחקרי זרע-proteomic. פרוטוקול זה מספק הסבר כיצד תאי זרע מבודדים מיותרת אשך cauda. בעקבות זאת, הליך העשרת 2 phosphopeptide TIO מתואר, תוך התייחסות ספציפית על איך לחלץ פפטידים מתאי הזרע מובחנים מאוד. גישת MS יכול לשמש כדי להבחין phosphopeptides שינוי אם היו להשוות את תאי זרע epididymal הזנב במדינה אחת (immotile או אי-capacitated) למשנהו (ניעתי, capacitated, acrosome הגיב, וכו ') מה שהופך את זה בגישה רבת עוצמה כדי לחקור זרע פונקציה.

Protocol

1. הכנת תרבות מדיה וכלים הפוך 200 מיליליטר של Biggers ויטן וויטן (BWW) 17 פתרון עובד על ידי הוספת 5.54 g NaCl, .356 גרם KCl, 0.25 גר 'CaCl 2, 0.162 g H 2 P KO 4, ו.294 MgSO g 4-1 ליטר של מים מילי- Q . זהו פתרון המניות ויכולים להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס עד חודש. מפתרון המניות, להוסיף 420 מ"ג של NaHCO 3 -, 200 מ"ג גלוקוז, 6 מ"ג נתרן פירובט, 600 מ"ג בסרום שור אלבומין, 0.74 חומצת החלב מיליליטר נתרן, ו 4.0 מיליליטר של חיץ HEPES 193 מיליליטר של מניית BWW. זהו הפתרון עובד, והוא תמיד עושים טרי ביום וequilibrated עד 37 ° C לפני השימוש. כדי להפוך את הצינורית, לקחת פוליאתילן צינורות (PE) עם קוטר פנימי של 0.4 מ"מ וקוטר חיצוני של 1.1 מ"מ ולהחזיק בחום נמוך יותר (בדרך כלל מתנול להבה) באופן שהצינורות מתחילים להתמוסס. מייד למשוך את צינורות outwארד למתוח ולהפוך את הקוטר החיצוני צר. Cut לייצר צמצום קצה אחד המאפשר לcannulation קל יותר של צינור הזרע. חותך את הקצה השני של הצינורית לכ -15 סנטימטרים. הכנס מחט G 30 לקצה הקהה, ולצרף מזרק 3 מ"ל לזה (חזר בו באופן מלא). הפוך שופר יניקה על ידי חיתוך אורך 20 סנטימטרים של צינור PE (4.2 מ"מ קוטר פנימי, קוטר חיצוני 6.4 מ"מ). הכנס שופר לקצה אחד. הכנס את בעל שפופרת זכוכית מיקרו-נימים וזכוכית מיקרו-הנימים עצמו (3 μl בדרך כלל לעכבר, 40 μl לחולדה). 2. ההסרה של Epididymides מעכבר להרדים עכברים על פי נהלים שאושרו IACUC ספציפיים לכל מוסד. קח את בעלי החיים ולעשות חתך קטן בצק האשכים כדי לחשוף את יותרת האשך. משוך את האשך ויותרת אשך מתוך החלל בעזרת זוג המלקחיים # 5 של השען. חותך את צינור הזרע כך שלפחות 1-2 סנטימטר להישאר מחובר ליותרת אשך cauda. בנוסף, חתך את הצינורות הפרוקסימלי efferent ורקמות חיבור יותרת האשך לאשך ולהסיר את מסלול הרבייה של גבר כולו. הנח את מסלול הרבייה של גבר כולו תחת מיקרוסקופ לנתח עם מגוון הגדלה בצו של 5-40X. 3. cannulating יותרת האשך קלטת את הצינורית למיקרוסקופ, כך ש1-2 סנטימטר של הסוף הצטמצם (קונוס-צורה) הוא חופשי וגלוי דרך העדשה. קח זוג # 5 המלקחיים של שען ובעדינות לאחוז כל צד של צינור הזרע ולמשוך את צינור הזרע אל הצינורית, כך שהצינורית נכנס לצינור הזרע. קח באורך של משי שאינו נספג שחור קלוע טופל (גודל 5-0) ולקשור קשר סביב צינור זרע cannulated. כאשר fr לחץ האוויר להבטיח את הקשר הוא משך בחוזקה כדי להחזיק את הצינורית בתוך צינור הזרעאום המזרק מיושם. 4. מדרדר או backflushing של הזנב epididymal תאים-זרע באמצעות # שענים 5 מלקחיים, לתפוס את הקצה הדיסטלי של epididymides cauda ולהסיר את albuginea Tunica על מנת לחשוף את אבובית epididymal יחידה. השימוש במלקחיים, משוך בעדינות את אבובית החוצה כדי לחשוף ולאחר מכן להפריד כדי ליצור פתח לזרע להשתחרר. דחוף בעדינות את 3 מיליליטר (עכבר) או 20 מיליליטר מזרק (עכברוש), כדי לגרש את האוויר מהמזרק לתוך צינור הזרע. בלחץ המתאים, תאים-זרע יתחילו לבוא לאט מתוך אבובית השבורה בקצה הדיסטלי של יותרת האשך cauda. בשלב זה, חלים יניקה לשופר לצייר תאי הזרע אל תוך נימי הזכוכית. הערה: בדרך כלל בעכבר, ניתן לקבל 2-3 μl של תאי זרע בהתאם לגילו של בעל החיים. רצון חולדה, בתשואה ממוצעת 30-40 μl. 5. כביסהוlysing תאי הזרע בהכנה לפרוטאומיקה לגרש את תאי הזרע מזכוכית הנימים לתוך 1 מיליליטר הפתרון של פתרון BWW (37 ° C) על ידי בעדינות נושבת לתוך הפומית או הצמדת מזרק וגירוש אוויר כדי לדחוף את הזרע החוצה של הנימים. ברגע שתאי הזרע מתפזרים, לשטוף 3x (XG 300, 5 דקות) עם BWW 1 מיליליטר להסרת חלבונים מזהמים. לאחר לשטוף הסופי, להסיר את supernatant. הערה: בשלב זה, אפשר להקפיא את תאי הזרע לשימוש מאוחר יותר. Solubilize חלבונים באמצעות 4 בחורים%, 2 M thiourea, ו -50 מ"מ טריס, pH 7.4 עבור שעה 1 עם vortexing לסירוגין. לאחר lysing התאים, צנטריפוגה (10,000 XG, 20 דקות), לקחת supernatant ולהעביר צינור חדש. הערה: בשלב זה, ניתן לבצע כימות חלבון. 6. דיסולפיד בונד הפחתה ואלקילציה הוסף 10 מ"מ DTT כריכוז סופי לחלבוני lysed, ווארטלשעבר ודגירה על RT למשך 30 דקות. הוסף 50 מ"מ idodoacetamide כריכוז סופי לlysate, מערבולת לדגור על RT במשך 30 דקות בחושך. 7. ממטרים כלורופורם מתנול לזרז את המדגם על ידי הוספת נפח של 1 lysate (400 μl כדוגמא), להוסיף כרך אחד (400 μl) של מתנול ונפח 0.5 כלורופורם (200 μl). מערבולת המדגם וספין (10,000 XG, 2 דקות). שים לב ששני שלבים יופיעו הבאים צנטריפוגה. מחק את כל אבל 2 מ"מ של השכבה העליונה (נזהר שלא להפריע לממשק). הוסף 1 נפח (400 μl) של מתנול, צינור היפוך בעדינות 1-2x לערבב ושוב ספין (10,000 XG, 15 דקות). בטל supernatant לבזבז וגלול אוויר יבש במשך 3-4 דקות. 8. טריפסין עיכול מחדש טריפסין באמוניום ביקרבונט 25 מ"מ המכיל אוריאה 1 M ליחס של 50: 1 (W / W; חלבון: טריפסין) וטופחו אובהrnight על 37 מעלות צלזיוס רצוי בסל"ד 700 על thermomixer. ספין (10,000 XG, 15 דקות) לגלולת חומר לא מעוכל. העברת supernatant לצינור חדש. 9. Phosphopeptide העשרה לבצע טיהור והעשרה של phosphopeptides מtryptic לעכל כפי שתואר קודם לכן 18. לדלל פפטידים tryptic של פי 10 במאגר DHB [חיץ DHB מורכב: 350 מ"ג / מיליליטר 2,5 חומצת dihydrobenzesulfonic (DHB), 80% (V / V) ACN (אצטוניטריל), 2% (V / V) TFA (trifluoroacetic חומצה)] ולהחיל לייבוש Tio 2 חרוזים (200 מיקרוגרם). השאר על הכתף בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. לשטוף את המדגם עם חיץ DHB, ספין ולהסיר supernatant. לאחר מכן לשטוף את המדגם שלוש פעמים עם חיץ לשטוף [80% ACN (V / V), 2% TFA (V / V)] כדי להסיר את DHB. לאחר הסיבוב האחרון, ישירות elute phosphopeptides באמצעות חיץ elution על ידי הוספת 25 μl של אמוניום הידרוקסיד 2.5%, פתרון pH ≥ 10.5. Sלהצמיד ולהסיר את supernatant. מייד לנטרל עם ~ 0.3 חומצה פורמית μl.

Representative Results

איכות התוצאות מכל ניתוח proteomic תלויה מאוד בחומר המוצא. עם MS המודרני, זיהומים קלים בהכנות מדגם קלות הרימו. לכן, זה קריטי, במקרה של פרוטאומיקה תא זרע, לבחור שיטה שנותנת זרע טהור ביותר. כפי שמודגם באיור 1, backflushing מדרדר משמשת לאחזור תאי זרע מאשך cauda. זה כרוך cannulating צינור הזרע עם צינורות PE שמאפשר ליישם לאט לחץ אוויר מהמזרק המצורף. איור 1 א ממחיש את יותרת האשך cauda יחד עם צינור הזרע. איור 1 הוא מקרוב זריקה של איך צינור הזרע קשור בי צינורית מוחדרת. בעושה, כל כך, תאים-זרע משתחררים בסוף נכרת של אבובית אחד מepididymides הזנב. כפי שניתן לראות באיור 2 א, התאים-הזרע מופקים מאזורי השיא של caudיותרת האשך ונשאב לתוך נימי זכוכית במצב שקט (איור 2). יש לכך כמה יתרונות על פני שיטות מסורתיות "לשחות למעלה", לא פחות מ מהם היא היכולת לבצע ניתוח phoshoproteomic של תאי זרע לפני ואחרי ההפעלה של תנועתיות. התאים-הזרע אז יכול להיות מגורשים לתקשורת של הבחירה של אחד. איור 2C (צד שמאל) מדגים כיצד הזרע נראה מייד לאחר גירוש לתקשורת BWW. רבים מהתאים בכבדות יחד. עם זאת, לאחר 10 דקות של יכולת התאים הוא הוכיח כי הם לשחות החוצה להומוגניות לפתרון (איור 2 ג, צד תאים מימין). מאז טכניקת backflushing יש השפעה קטנה מאוד על תאי הזרע, אנו מקבלים קרובים ל -100% ותנועתיות התאים לפזר במהירות לכלי התקשורת ללא פרובוקציה חיצונית. בניסוי backflushing טיפוסי, זרע התאושש מהשויצרי העכבר מכילבין 1-5 x 10 6 תאים. זה תלוי מאוד בגילו של בעל החיים ויכול להשתנות מזנים שונים של עכברים. בעכברוש נורבגי, אנחנו בדרך כלל להשיג 200 x 10 6 תאים-זרע, ± 20%. איור 2 ד מייצג את טוהר של תאי זרע המתקבל מיותרת אשך cauda החולדה. חוץ מהמדגם עצמו, אחד הנושאים המרכזיים הנוגעים להכנת מדגם הוא התשואה של עיכול טריפסין. ממטרים חלבון ממלאים תפקיד מרכזי, לא רק בהסרת חומרי ניקוי לא רצויים ומלחים, אשר שניהם אינם מתיישב עם MS, אלא גם בdenaturing חלבונים. מצאנו הממטרים מתנול, כלורופורם לעבודה הטוב ביותר. לא רק שדווח בהליך זה כדי לזרז חלבונים בשפע נמוכים יותר טובים מאחרים, כולל ממטרים TCA 19, אבל יש לו יתרונות נוספים. בעקבות המשקעים TCA, זה לעתים קרובות יש צורך להתקין מחדש את ה- pH לאחר השעיה של גלולה TCA שיכול להישאר דיחומצי. למרות גלולה זירז של TCA ניתן לכבס בפתרונות אורגניים גבוהים כדי להסיר את החומצה, זה מוסיף לדגום טיפול וirreproducibility של תוצאות. אי לנטרל את החומצה יגרום תשואות פפטיד tryptic עניות. הממטרים מתנול, כלורופורם הוא לא רק מהירים, אבל לא להפוך לחומצת המדגם. איור 3 ממחיש את גלולה החלבון לראות בדרך כלל משל מדגם בין שלבי ביניים התחתונים ועליונים 100 מיקרוגרם. הבידוד של phosphopeptides יכול להתרחש במספר הדרכים; עם זאת שחזור תלוי איך המדגם כבר טיפל עד וכולל שלב זה. אחת השיטות הנפוצות יותר, הוא פיתוח Tio 2, שפותח במקור על ידי הקבוצה של מרטין לארסן 18,20,21. למרות שתואר כתהליך להשתמש בmicrocolumns, אנחנו יכולים להשיג נתונים לשחזור באמצעות כרומטוגרפיה אצווה. הצלחת התהליך תלויה מאוד בחיץ elution, אשר חייב להיות מטורף דואר עם ההרכב הנכון; אחרת phosphopeptides לא eluted בכלל. שחזור של נתונים הפרוטוקול והנציג מTio 2 מועשר phosphopeptides מזרע epididymal cauda בהלא נעימה ב( למעלה איור 4) ומדינת ניעתי (למטה איור 4) ממ '/ שניתן לראות z 650-670. אנחנו הוכחנו כי מדובר בטכניקה מאוד לשחזור גם בעת שימוש משכפל ביולוגי 17. הפסים הכחולים המופיעים לאורך הזמן הם פפטידים משחררי מC18 ננו-טור כריכוז של עליות אצטוניטריל. ברור, באוכלוסיית הניע (n = 3 הראה, n = 8 פועלים בדרך כלל), יש אשכול פפטיד, עם מסת monoisotopic סביב טווח Da 651.5 שאינם קיימת לחלוטין בטווח הלא-הנעים ב. ספקטרומטר מסת טנדם לאחר מכן נעשה שימוש כדי לזהות הפפטיד הזה. 546 / 51546fig1highres.jpg "/> תמונת Cannulation של יותרת האשך cauda (א) ליותרת אשך cauda: איור 1.. הצינורית עצמו הדביקה את לחשוף כ 1-2 סנטימטר של הסוף-משך מראש. זה מוכנס לתוך צינור הזרע באמצעות מלקחיים # 5watchmakers קנס. (ב) הצינורית מוחזקת במקום על ידי קשירת משי משובח סביב קטע המכיל את שני צינור זרע ואת הצינורית. מהעכבר, כ 2-3 μl של תאי epididymal הזנב ונוזל נאספים בריכוז של 1 x 10 6 / μl. מהעכברוש (עולם), כ 30-40 μl של נוזל מתקבל בריכוזים דומים. איור 2: נימי זכוכית המשמשות לאיסוף תאי זרע epididymal מוסמך. אבובית אחת מהשיא של דואר cauda () pididymis הוא מבודד ושבורה. המיקום המשוער שממנו זה מתרחש מוצג. (ב) בחלק העליון של התמונה מראה צינור נימי זכוכית ריק והתחתון מראה אחד מעכברוש backflushed בעבר. אין זיהום דם וזיהום תאי אפיתל מינימאלי. (ג) כפי שתאי הזרע עדיין חי בנוזל epididymal, הם לא התחילו להפעיל. כאשר תאי הזרע בתחילה גורשו לפתרון BWW, הם יוצאים כ" מחרוזת "קומפקטית (צד שמאל). היכולת של התא הוקמה בקלות, שכן לאחר 10 דקות רוב התאים-הזרע לשחות לפתרון ללא כל הפרעה חיצונית (צד ימין). (ד) תמונה של aliquot של תאי epididymal הזנב מייד אחרי שהם כבר עזבו לשחות מתוך מדגים את טוהר של התאים. g3highres.jpg "/> איור 3:. ממטרים מתנול-כלורופורם ברגע שהתאים-הזרע היה solubilized, החלק המסיס הוא מתנול, כלורופורם זירז כדי להבטיח denaturation של החלבונים וההסרה של חומרים מזהמים. גלולה החלבון מופיעה בממשק בין שלבי מתנול / מים וכלורופורם. השכבה העליונה היא הסירה בזהירות כדי לא להפריע גלולה זו. זה נפוץ לעזוב על 2-3 מ"מ של השלב העליון באופן שלא הולך לאיבוד חלבון. איור 4:. פרופיל phosphopeptide אופייני Tio 2 -enriched שימוש בפרוטוקול המתואר, תאים-זרע epididymal הזנב היו מבודדים בשתי immotile (למעלה, N = 3) או מדינות ניעתי (למטה, N = 3). אשכול פפטיד עם מסה מונו-איזוטופי של ~ 651.5 Dמוצג להיות נוכח באוכלוסיות הניע אבל נעדרו לחלוטין בimmotile אלה (החץ). השוואות מסוג זה מכונים "(המבוסס MS-) ללא תווית". מסת פפטיד וזמן שמירה משמשים לאחר מכן כדי למקד את המתחם לספקטרומטריית טנדם-מסה ולזהות את החלבון שממנו נגזר פפטיד.

Discussion

הצעדים הקריטיים לניתוח proteomic מוצלח ושחזור של תאי זרע הם: 1) טוהר החומר המוצא; 2) הסרת מלחים וחומרי ניקוי לא רצויים; 3) denaturing חלבונים במלוא היקפם כדי לאפשר טריפסין לעכל תשואה גבוהה של חלבונים ו- 4) מזעור מדגם הטיפול כדי לצמצם את אובדן פפטיד.

כדי backflush יותרת האשך cauda בהצלחה, זה הכרחי כדי לאתר את האזור שממנו הזרע תצא. במקרה של שני עכברים ועכברים, זה בשיא של האזור הקעור, באמצע אזור הזנב של יותרת האשך (ראה איור 2 א). אם אחד מגיע צעד נוסף לעבר צינור הזרע, backflushing קלה יותר ושיעור ההצלחה הוא בדרך כלל גבוה יותר. עם זאת, זה בא על אובדן מספרי זרע. לחלופין, אם אחד מנסה להעביר לקרבה גדולה יותר לקורפוס, אז הסכום של לחץ דרוש כדי לדחוף את הזרע בחזרה דרך epididymצינוריות אל היא לעתים קרובות כל כך גבוהות, שניזק ליותרת האשך באופן בלתי נמנע מתרחש.

Backflushing של יותרת האשך מבוצעת באופן מסורתי באמצעות שמן מינרלי מים רוויים ותמיסת מלח מאוזנת במזרק עצמו כמדיום כדי להסיר את תאי הזרע 22-25. שני ההליכים הם פוטנציאל בעייתיים של LC-MS. ראשית, מינרלים עלולים לחסום את ננו-עמודי ננו-C18 המשמשים בעצם בעולם לניתוח וטיפול proteomic יש לקחת כל כך אף אחד, כי הוא מועבר בנוהל. במקרה זה, זה בלתי אפשרי להמשיך והמדגם איבד במהות. זה ניתן להתגבר על ידי השימוש בBWW או פתרונות מלח מאוזנים אחרים במזרק, עם זאת, למרות שזה מוצלח, אנו מוכרים כי רבים הזרע הפכו ניע בהקדם פתרון BWW בא במגע ומעורבב עם epididymal הזנב תאים. כדי לעקוף בעיה זו פשוט backflush תאי הזרע עם אוויר. לא רק הוא quality של תאי זרע דומה לזו של שיטות המבוסס על נוזל, אבל הכמות זהה.

Phosphoproteomics הוא אולי אחת הדרכים היחידים להקים בי מסלולי איתות מתרחשים בהודעה שפיכה-תאים-זרע. אחד מהמסלולים העיקריים שאנו חוקרים הוא התהליך של capacitation. תאים-זרע חייבים לעבור "capacitation" לפני שהוא מסוגל להיקשר לביצה. בפועל, זו מושגת בעצם על ידי דוגרים תאים-זרע לתקופה של זמן (דקות 40 עכבר; עכברוש 1.5 שעות; 3-24 שעות אדם) בפתרון BWW עם אלבומין בסרום. בעבר, אנחנו ואחרים הראינו תפקיד במשך כמה קינאז המעורב בcapacitation. של עניין, מחיקה של PKA μ II לייצר עכברי תאי זרע ששוחים באופן ספונטני במבחנה, אך לא יכול לעבור היפר 26. האחרון הוא סימן היכר של capacitation, לפיה תאי זרע לשנות את דפוס השחייה שלהם ממהירות גבוהה, משרעת נמוך, לנמוךמהירות, משרעת גבוהה הכה תדירות. הראינו קינאז במורד הזרם מעורב בתהליך זה כולל pp60-cSRC (SRC) 13,27 c-כן 28 ו- c-ABL 14. מעניין, עיכוב של SRC מפסיק זרחון טירוזין capacitation תלוי 13. עם זאת, ניתן להתגבר עם חומצת okadaic, המצביע על כך SRC אינו מעורב ישירות בתחילה הכללית של זירחון טירוזין 29 אך עשוי להסדיר phosphatase 29. הבעיה בשימוש בBWW כמדיום כדי לאלץ את תאי זרע אל מחוץ ליותרת האשך היא שהופעל בעבר תאים-זרע של העכבר, רק לקחת כ 40 דקות לcapacitate. בהתחשב בכך שבידוד של תאי זרע יכול לקחת 5 דקות / עכבר ולעתים קרובות כמה עכברים משמשים בניסוי, ולאחר מכן תאי זרע יהיו בשלבים שונים של בגרות בתחילת הניסוי. כדי להתגבר על זה, לחץ אוויר יכול לשמש כדי לדחוף את תאי הזרע מאשך הזנב לצינורית זכוכית. לא רק שכל inact הזרעive ובעצם כפי שהם היו נמצאים בסביבת הזנב, זה עושה את זה ניתן להשוות phosphoproteomics הלא-נעים ובניע.

לדוגמא טיפול לphosphoproteomics צריכה להישמר עד למינימום כאשר משווים את תאי זרע בשתי מדינות פונקציונליות שונות. השימוש בכלורופורם מתנול על פני שיטות מסורתיות אחרות של משקעים חלבון 1) מצמצם את הצורך בצעדים נוספים כביסה, 2) מסיר כמעט את כל עקבות של מלחים ושומנים ו 3) יש יכולת מוכחת כדי לזרז חלבוני שפע נמוכים מעל TCA 19. ממטרים חלבון לפני עיכול טריפסין מומלץ שכן לא רק זה לעזור ללפגל חלבון (שעוזר לעיכול טריפסין), אבל מסיר רב של מטבוליטים MS-עולה בקנה אחד הנוכחים בתא.

ההשוואה של phosphopeptides הזרע ניתן לעשות זאת במספר הדרכים. ברמה הבסיסית, השוואה פשוטה של ​​phosphopeptide זוהה במדגם אחד, שלבעודמדגם בתהליך המכונה "ספירת רפאים" ניתן לעשות זאת. עם זאת ביקורת הייתה בגישה זו בעצם בגלל לימודי proteomic מוקדמים באמצעות חזרות נמוכות (לדיון מלא יותר לראות Lundren et al. 30). גישה מתוחכמת יותר היא להסתכל על עוצמת ההמונית הורה פפטיד ולהשוות את זה עם דוגמאות האחרות (השוואה ללא תווית). בדוגמא מוצגת באיור 4, ניתן לראות פפטיד נעדר מהלא-נעים ב( למעלה איור 4), אך קיים בניע תאים-זרע (בחלק תחתון איור 4) ממ '/ z 650-670. תהליך זה, המכונה כימות ללא תווית מבוססת MS הוא אסטרטגיה ללא תווית.

אסטרטגיה חלופית הנפוצה להפחית את כמות הריצות הנדרשות לכימות proteomic היא להשתמש איזוטופים. ככל שהמסה של איזוטופ היא שונה, ספקטרומטר המסה יכול לשמש כדי להשוות את העוצמות של eluting פפטידים. עם זאת, שלא כמו רוב סוגי תאים אחרים, כמה תיוג איזוטופי לא יכול להיות מיושם על תאי זרע. לדוגמא, התוספת של איזוטופים יציבים (איזוטופ אחד כבד מקבלת הוסיפה למדגם אחד, בעוד בגרסה קלה יותר מקבלת הוסיפה למשנהו) ניתן להשתמש בתרבית רקמה. כאשר איזוטופים מתמזגים בחלבון, ניתוח פרוטאומיקה יכול להתבצע על ידי שילוב של שתי הדגימות (ריבוב). עם זאת, במקרה של תאי זרע, זה לא יכול להיעשות, פשוט מכוח העובדה ש1) תיוג איזוטופ דורש כמה קטעים (עד 8) בתרבית רקמה ו- 2) תאי הזרע אין שעתוק הגנים גרעיני ותרגום, ולכן, הם לא יכולים לשלב איזוטופים לכל החלבון שלהם בכל מקרה. אחת דרכים לעקוף זאת היא להורות עכברי radiolabelled, לעומת זאת, אלה הם ידועים לשמצה יקרים. גישה חלופית היא להשתמש בתג כימי. הדבר נעשה כאשר עכברים-capacitated לא היו בהשוואה לעכברים capacitated. במקרה זה, D 0 וD <sub> 3 -label שימש להבחין בין מדגם אחד למשנו בספקטרומטר המסות 31. גישות אחרות יכולות לכלול השימוש בiTRAQ (תג isobaric לquantitation יחסי והמוחלט), לפיה lysines מסומנים כימי עם איזוטופים מסה שונים; iCAT (תג זיקת איזוטופ מקודד) לפי cysteines מסומנים עם איזוטופים מסה שונים ותיוג מים כבד וקל.

בכל מקרה ומקרה, עם זאת, דבר אחד צריך להיות כל הזמן בראש. MS מדווח רק את מה שקיים במדגם, ואת זה הוא השתקפות של כל מה שקרה שלדוגמה עד לנקודה ש. מזעור טיפול מדגם תוך מיקסום התשואה בכל שלב הוא הכרחי לניתוח proteomic מוצלח.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone Aldrich 195464
2-D Quantitation Kit VWR (GE Healthcare) 80-6483-56
Albumin from bovine serum Sigma A7030
Ammonia Solution 25% Merck 1.05432
Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
Calcium Chloride Sigma C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate Research Organics 1300C
Chloroform BDH 10077.6B
di-sodium hydrogen phosphate Merck 1.06580
Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779
Formic Acid Sigma O6440
Glucose Sigma G6152
Glutamine-L Sigma G7513
Hepes (free acid) Sigma H3375
Iodoacetic acid free acid Sigma I4386
Lactic Acid Sigma L1750
Magnesium Chloride Res. Org. 0090M
Methanol Merck 10158.6B
Percoll (sterile) VWR (GE Healthcare) GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt ThermoFisher Scientific (Pierce) PIE78420
Potassium Chloride Sigma P9333
Potassium Hydrogen Carbonate Medical Store CH 600
Sodium Bicarbonate Sigma S3817
Sodium Chloride  Sigma S7653
Sodium di-hydrogen phosphate Merck 1.06346
Sodium hydrogen carbonate BDH 10247.4V
Sodium Pyruvate Sigma S8636
Tris Ultra Pure Grade Amresco (Astral) AM0497
Trypsin Gold-Mass Spec Grade Promega V5280
Urea Sigma U5128
Zinc Chloride Sigma Z0173
0.4 mm polyethylene tubing Goodfellow ET317100
30 gauge needle Terumo NN2038R
3 mL syringe Terumo SS035
4.2 mm polyethylene tubing Goodfellow ET317640
Braided silk (5-0) Dynek CSS0100
Trichloroacetic acid Sigma 299537
TiO2 beads (from disassembled column) Titansphere 6HT68003
Eppendorf Tube Eppendorf 22431081
C7B30 Sigma C0856
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
  2. Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
  3. Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
  4. Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
  5. Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. . Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).
  6. Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
  7. Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C., Neill, J. D. . The Epididymis. 3, 1072-1120 (2006).
  8. Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
  9. Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
  10. Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
  11. Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
  12. Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
  13. Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
  14. Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
  15. Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).
  16. Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
  17. Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. . The culture of mouse embryos in vitro. , (1971).
  18. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
  19. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
  20. Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
  21. Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
  22. Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
  23. Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).
  24. Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
  25. Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
  26. Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
  27. Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
  28. Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
  29. Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
  30. Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
  31. Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).

Tags

Phosphopeptide AnalysisRodent Epididymal SpermatozoaSperm MaturationPost-translational ModificationsProtein PhosphorylationTiO2 Affinity ChromatographyMass SpectrometryTestisEpididymisSpermatozoonMotilityEgg Recognition

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Baker, M. A., Hetherington, L., Weinberg, A., Velkov, T. Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa. J. Vis. Exp. (94), e51546, doi:10.3791/51546 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image