评估具体物种的贡献颅面开发利用鹌鹑，鸭嵌合体

1，准备钨针切断的钨棒在一半使用钢丝钳使杆不弯曲。 通过5中的硼硅玻璃四分之三巴斯德移液管的锥形端部螺纹杆。 留下约3/4的杆附着的出玻璃，附着在杆的移液管尖的小珠“热熔性粘合剂”（HMA），这是用于胶枪将胶粘的。 HMA中应迅速融化在酒精火焰，小心不要烫伤胶水，并产生黑烟。 利用一对钳子的，弯曲的钨棒的端部（大约1/4的上端）直到45°的角度为止。 握住巴斯德吸管，将约1/8的钨棒的前端的进丙烷喷灯的火焰。保持尖端稳定，准确地垂直于火焰。 拔出注射针的火焰瞬间童综合的一个微小的橙色斑点10苍蝇落针。 2，准备斯佩曼移液器使用本生灯，加热巴斯德吸管的窄端，直到玻璃不久以后锥度开始融化。从火焰中删除和拉尖，直到吸管变成密封。可以肯定，仍存在具有大约0.7-1.0毫米的外径渐缩部分的一部分。打破密封端关闭从锥形长约4厘米。 连接橡胶管的周围2英尺（60厘米）到移液管的宽（开口）端。吹在橡胶管的另一端，以确保没有空气可以通过巴斯德吸移管的锥形部分。 使用丙烷燃料筒用附属的铅笔焰炬，加热略低于锥形的开始上移液管的一侧上的椭圆形区域。通过橡胶管与压力的微量（压力约需要说的莱特开始时的量吹出空气很平缓，并不断R“P”在会话级）。当玻璃变得柔软的一面，并开始向外扣，迅速从火焰取出吸管吹硬稳定通过橡胶管。这会导致玻璃的加热部分，以形成香肠状的气泡可能弹出，这是好的。如果气泡太小，尝试熔化和再吹玻璃。最后打开的窗口中的玻璃应在0.25（6.35毫米）宽的（12.7毫米）0.5长。 指着锥形端朝上，刮泡成，同时通过油管轻轻一吹，以防止玻璃碎片进入吸管的玻璃废物容器。 使用丙烷火焰，燃烧掉泡沫和消防抛光打开的窗口两侧的剩余边缘。注意不要融化吸管的轴。 使用金​​刚石点铅笔，从窗口得分移液管的锥形端部中（30mm）的约1.25和折断的前端用钳子使吸管开口裁切整齐（丢弃移液器碎或不均匀的提示）。 使用镊子和从醇燃烧器的火焰的边缘上，在（9.5毫米）的从尖端弯曲的吸管0.375的狭窄部分，以约60°的角度，使得所述弯曲部是在垂直平面内时，窗开口是为右手使用和11:00，以方便左手使用1点的位置。这一步是在一个无风的外壳最好进行。 火抛光用解剖显微镜下的酒精火焰尖端。千万不要以关闭尖端而是保持首轮，没有任何收缩顺利。 切1中（25毫米）一块橡胶管，喷管件的用70％乙醇，并在移液管的轴滑动，管子，直到窗口开口被完全盖住。此功能为斯佩曼吸管的“隔膜”。 放置一个乳胶2毫升球在移液管的底部开口。灯泡保持在斯佩曼吸管的负压。 练习使用斯佩曼吸管，从一个培养皿有明显斑点在显微镜下转约100-200微米，直径层析珠的另一显着位置。 要清洁斯佩曼移液管，取出橡胶球和地点吸管，尖向下，在一个高脚烧杯内衬棉花或纱布在底部，装有蒸馏水和玻璃器皿洗涤剂。 3，消毒和孵化蛋擦蛋用70％乙醇，然后将鸡蛋塑料蛋盘。 在37.5℃和85-87％设定鸡蛋在加热的孵化器。 卵孵化，直到他们达到HH9.5，鹌鹑和48小时的鸭子约26小时。 4。窗口蛋从用钳子鸡蛋的顶部取下一小片外壳，小心不要刺破内壳米embrane。 由1寸毫针使用注射器用18 G，戳一个洞在蛋的尖端最窄，收回约1-2毫升的蛋白中。 将透明胶带多年来在外壳孔和穿刺标记。 用弯剪（通过透明胶带）剪下一个“窗口”沿着蛋的顶面。 5，可视化胚胎和准备手术用玻璃棒轻轻刷过胚胎少量中性红（0.02克/毫升汉克的BSS）。 切卵黄膜和使用火焰削尖的钨针在胚胎拉出。 通过将透明胶带在窗口重新密封的蛋。 6，供体组织的供体胚胎分离从供体胚胎的蛋窗口中删除磁带。 从供体胚胎的外胚层相邻切神经褶，使狭缝在两个SID神经管的ES，使用火焰削尖的钨针（如上所述制备）。 然后，贯穿神经管在移植物的期望的前部和后部的水平，并从神经管的其余部分分开的接枝。 从使用一个斯佩曼吸管或其他类型的微量的供体胚胎中取出神经褶。 然后，从窗口卸下磁带上的主机蛋和使用斯佩曼移液管放置供体神经褶沿着相邻的神经管将接收移植的区域中的宿主胚。 7，分离出宿主组织与移植供体组织从主机胚胎的神经管分离的神经褶，因为完成了捐助。小心取出一个同样大小的移植物为供体组织。 这轻轻的宿主组织推动远离胚胎。 然后，用钝钨针，或一米的圆尖cropipette，轻轻移动捐助神经折叠成宿主神经管，保持适当的前 – 后和背腹方向。确保移植物是藏在沿线两侧，但千万不要去戳或损坏下层组织。为了保持原来的方向音符的轨迹从中性红的供体组织或差分染色任何不对称。我们还光笔施主胚胎与随附切除的组织，以及嵌合后立即手术。 无菌盐水中应加入鸡蛋，如果主机胚胎显示了干燥的迹象。 现在，重新仔细密封并标记蛋，然后轻轻返回到高湿度培养箱中（70-80％），其中所述嵌合胚胎可发育至所需的阶段进行分析。 嵌合体的8。收藏一定要收集新鲜的冷塞拉的固定液嵌合体胚胎，并立即将它们放置在RO克尔在4℃的O / N固定。这将允许更多的抗鹌鹑抗体敏感的检测鹌鹑细胞。 通过RT-qPCR的基因表达分析，直接在液氮中之前提取RNA冷冻胚胎。