Vaccinia Reporter Vira til kvantificering Viral Funktion på alle stadier af genekspression

Traditionelt er virus udtryk undersøgt ved hjælp af molekylærbiologiske teknikker (fx Northern blotting, Western blotting, microarray hybridisering, osv.) ^1. Mens disse metoder er i stand til at give detaljerede oplysninger med hensyn til at kategorisere udtryk ændringer i de enkelte mRNAer eller proteiner, er de typisk ikke modtagelig for real-time og high-throughput processer. Alternative metoder, der anvender fluorescens-baserede journalister er blevet anvendt tidligere, når du arbejder med poxviruses; Imidlertid har deres udvikling og anvendelse er blevet motiveret af forskellige mål. Flere sådanne metoder blev udviklet til udvælgelse af rekombinante vira ^2,3. Disse teknikker udtrykker EGFP på korrekt inkorporering og ekspression af exogent DNA fra rekombinante vaccinia kloner. Tilsvarende flere vacciniastammer stabilt udtrykker opløselig EGFP eller GFP-mærkede proteiner udtrykt i en nativ vaccinia-promotor har været meget anvendt. Disse er typtisk bruges til at kvantificere virus indrejse og replikation i løbet af antistofbaserede neutraliseringsassays, kemisk hæmning, eller sammenligning af antiviral effektivitet ^4-6. Mens disse vira har vist sig nyttige, er de begrænset i deres evne til at give detaljerede oplysninger om det punkt hæmning på grund af deres brug af et enkelt tvetydig tidlig / sen viral promotor. Tidligere fremgangsmåder har også gjort brug af EGFP protein med suboptimale signal-støj-egenskaber.

På grund af kompleksiteten af poxvirus replikation og manglen på eksisterende værktøjer til rådighed til at analysere real-time ændringer i virusgenekspression, har vi udviklet en suite af single og multi scene reporter vira ^7,8. Som beskrevet i tidligere publikationer, disse vira udtrykker et, to eller tre spektralt forskellige fluorescerende proteiner fra native vaccinia promotorer i den tidlige, mellemliggende eller sene stadier i infektion. Disse vira kan være osed som indikatorer for virus replikation fremskridt ved hjælp af en fluorescens mikroskop og de er lige velegnede til high-throughput plade-og-reader assays. Disse vira er let at bruge i stedet for vildtype-virus, der vokser med lignende kinetik for at nå tilsvarende titre ^7. Under planlægningen og oprettelsen af ​​disse vira, var meget omhyggelig med at vælge fluorophores der har høje signal-til-baggrund karakteristika med overlegen folde effektivitet til at lette pålidelig kvantificering med hurtig tilbagemelding til ændringer i udtrykket (Venus, mCherry og TagBFP). Derudover blev kombinationer af virale promotorer valgt som producerer high fidelity, entydig trinspecifik udtryk, der giver oplysninger om hele spektret af tidlige (C11R promotor), mellemliggende (G8R promotor) og sene (F17R promotor) genekspression i modsætning til tvetydige tidlig / sen initiativtagere.

Disse vira kan anvendes som et redskab til investigating livscyklus prototypiske poxvirus, vaccinia virus. Meget er stadig ikke kendt om samspillet host-virus på trods af sin lange historie undersøgelsen. Vaccinia er kompleks, der producerer over 200 unikke proteiner, hvoraf mange er immunmodulerende og vært antagonistisk. Efter infektion, vacciniavirus begynder straks tidlig mRNA-transkription. Dette lettes af en RNA-polymerase og transkriptionsfaktorer, der blev indlæst på det virale genom i løbet af virion emballage og holdes i et midlertidigt afbrudt tilstand, indtil efterfølgende infektion. Denne tidlige ekspression producerer proteiner, der kræves til undertrykkelse af værtens immunsystem (mRNA hætteaftagning, dsRNA binding og lokkemad-receptorproteiner samt inhibitorer af apoptose, stress respons, og Toll, IL, og NF-KB-signalering) og genomreplikation. Tidlig udtryk producerer også transkriptionsfaktorer der er nødvendige for mellemliggende udtryk. Intermediate udtryk omfatter ekspression af sene transskription fase faktorer. Detudtryk kaskade fører til produktion af strukturelle og enzymatiske virus proteiner under sene stadier af infektion, som er nødvendige for fuldstændig samling af modne vaccinia virion.

Vores sæt af fluorescerende reporter vira tillader hurtig fremskridt i forståelsen af ​​poxvirus biologi. En af de mest almindelige og tidskrævende metoder inden for virologi er vækstassay. Dette involverer typisk at inficere celler, fastlæggelse af en række behandlinger, høst-virus ved at lysere inficerede celler og kvantificere den resulterende virale titer ved plaque-assay. Brug af reporter virus beskrevet her tillader tidstro måling af virusvækst, der let kan analyseres og sammenlignes mellem mange behandlinger, der udføres parallelt. Vi forudser dette sæt af reagenser vil blive anvendt i forskellige protokoller til at identificere ændringer i viral genekspression som reaktion på lægemiddelbehandling, RNAi knockdown eller værtsspektrum begrænsning.

Denne metode gør det muligt også højt indhold analyse på en større skala end tidligere tilgængelige, giver mulighed for high-throughput antivirale narkotika skærme til specifikt definerede målgrupper stadier af interesse. Mens mange potentielle behandlinger til bekæmpelse af poxvirus-infektion er blevet identificeret, er den eneste FDA-godkendte behandlinger er effektive til behandling af poxvirus-infektion er den acykliske phosphonat nucleosid Cidofovir, og behandling med vaccinia immunglobulin ^9,10. På trods af udryddelsen af kopper i 1977 ^11, koppevira forblive en væsentlig trussel mod menneskers sundhed ^12.. Ophør af udbredt vaccination mod Variola virus har ført til øget følsomhed over for andre koppevira ^13. For eksempel er områder i Centralafrika tidligere var beskyttet ved vaccination oplever en kraftig stigning i Monkeypox virusinfektioner ^14. Betydelig bekymring har også væretfremføres vedrørende latente tilbøjelighed til udsætning af Variola-virus. På grund af de begrænsede behandlinger øjeblikket er til rådighed, er der et presserende behov for udvikling af nye behandlinger. Disse reporter vira tillade hurtig og high-throughput lille molekyle inhibitor screening for hæmning af en bestemt fase af viral replikation. Identifikation af inhibitorer, der er målrettet virusekspressionssystemer etaper i øjeblikket ikke målet for hæmning vil lette udviklingen af ​​kombinationsbehandlinger med øget styrke.

Meget kan udledes om vaccinia cellebiologi ved at observere ændringer i hver etape er genekspression. Dæmpning ved kemisk eller genetisk manipulation af en inficeret værtscelle udtrykkes typisk i form af reducerede virale titere. Men ved at sammenligne ændringer i hver fase af den virale udtryk kaskade, kan man få en mere komplet forståelse af, hvordan virus fitness er virkningened af en bestemt behandling. Disse data har vist sig at korrelere godt med den traditionelle virustiteren output, men give mere detaljerede mekanistisk information samt høj throughput kapaciteter ^7.