Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Traditioneel wordt virusexpressievectoren bestudeerd met behulp van moleculair biologische technieken (bijvoorbeeld Northernblotting, western blotting, microarray hybridisatie, etc.) ^1. Hoewel deze methoden kunnen gedetailleerde informatie betreffende categoriseren expressie veranderingen van afzonderlijke mRNA of eiwitten zijn, zijn ze meestal niet ontvankelijk voor real-time en high-throughput processen. Alternatieve benaderingen met behulp van fluorescentie gebaseerde reporters zijn eerder toegepast bij het werken met poxviruses; echter, is hun ontwikkeling en gebruik ingegeven door gevarieerde doelstellingen. Verschillende van dergelijke werkwijzen zijn ontwikkeld voor de selectie van recombinante virussen ^2,3. Deze technieken uiten EGFP op een correcte integratie en expressie van exogeen DNA van recombinant vaccinia klonen. Ook verscheidene vaccinia stammen die stabiel EGFP oplosbaar of GFP-gemerkte eiwitten tot expressie gebracht onder een natieve vaccinia promoter zijn op grote schaal gebruikt. Deze zijn typtisch gebruikt om virus entry en replicatie tijdens antilichamen gebaseerde neutralisatiebepalingen, chemische remming, of vergelijking van antivirale effectiviteit ^4-6 kwantificeren. Hoewel deze virussen nuttig zijn gebleken, zijn zij beperkt in hun vermogen om gedetailleerde informatie over de bijzondere inhibitie door het gebruik van een dubbelzinnige vroege / late virale promoter. Vorige werkwijzen hebben ook gebruik van EGFP eiwit met suboptimale signaal-ruis-eigenschappen.

Vanwege de complexiteit van pokkenvirus replicatie en het ontbreken van bestaande hulpmiddelen beschikbaar om real-time veranderingen in virale genexpressie assay, hebben we een reeks van een of meerdere stage reporter ^7,8 virussen ontwikkeld. Zoals beschreven in eerdere publicaties, deze virussen uiten een, twee, of drie spectraal verschillende fluorescerende eiwitten uit autochtone vaccinia initiatiefnemers tijdens de vroege, midden of late stadia in infectie. Deze virussen kunnen onsed als indicatoren van het virus replicatie vooruitgang met behulp van een fluorescentie microscoop en ze zijn even goed geschikt voor high-throughput plaat-en-reader gebaseerde testen. Deze virussen zijn makkelijk te gebruiken in plaats van wild type virus, groeit met vergelijkbare kinetiek gelijkwaardige titers ⁷ bereiken. Bij de planning en het creëren van deze virussen is veel zorg besteed aan het selecteren van fluoroforen die hoge signaal-achtergrond kenmerken met superieure vouwen efficiëntie betrouwbare kwantificatie met snelle feedback aan veranderingen in expressie (Venus, mCherry en TagBFP) vergemakkelijken. Bovendien, combinaties van virale promotors werden gekozen die high fidelity, eenduidige fase-specifieke expressie, het verstrekken van informatie over het volledige scala van vroege (C11R promotor), intermediair (G8R promotor) en late (F17R promotor) genexpressie te produceren, in tegenstelling tot dubbelzinnige vroege / late promoters.

Deze virussen kunnen worden gebruikt als instrument voor INVEstigating de levenscyclus van de prototypische pokkenvirus, vaccinia virus. Veel is nog niet bekend over de host-virus interactie ondanks de lange geschiedenis van de studie. Vaccinia is complex, productie van meer dan 200 unieke eiwitten, waarvan vele zijn immunomodulerende en gastheer antagonistische. Na infectie begint vacciniavirus onmiddellijk vroege mRNA transcriptie. Dit wordt vergemakkelijkt door een RNA-polymerase en transcriptiefactoren die op het virale genoom werden geladen tijdens virion verpakking en vastgehouden in een onderbroken toestand tot daaropvolgende infectie. Deze vroege uitdrukking produceert eiwitten vereist voor het onderdrukken van de gastheer immuunsysteem (mRNA decapping, dsRNA opslag en decoy receptor eiwitten alsook remmers van apoptose, stressrespons en Toll, IL en NF-KB-signalering) en genoom replicatie. Vroege uitdrukking produceert ook transcriptiefactoren die nodig zijn voor intermediaire expressie. Intermediate meningsuiting de expressie van late stadium transcriptiefactoren. Dezeexpressie cascade leidt tot productie van structurele en enzymatische virus eiwitten tijdens de late stadia van de infectie, die noodzakelijk zijn voor volledige assemblage van het rijpe virion vaccinia.

Onze reeks van fluorescerende reporter virussen zorgt voor een snelle vooruitgang wordt geboekt in het begrijpen van pokkenvirus biologie. Een van de meest voorkomende en tijdrovende methoden op het gebied van de virologie is de groei assay. Dit betekent meestal infecteren cellen vaststelling van een reeks behandelingen, oogsten virus door geïnfecteerde cellen lyseren en kwantificeren van de virale titer verkregen door plaque assay. De reporter virussen beschreven maakt real-time meting van de virusgroei die gemakkelijk kunnen worden getest en vergeleken tussen talrijke behandelingen parallel uitgevoerd. Wij voorzien deze set reagentia worden gebruikt in verschillende protocollen voor het identificeren van veranderingen in virale genexpressie in respons op behandeling met geneesmiddelen, RNAi knockdown, of host range beperking.

Deze methode maakt het ook mogelijk hoge inhoudsanalyse op grotere schaal dan voorheen beschikbaar, waardoor voor high-throughput anti-virale medicijn schermen voor specifiek omschreven doel fasen van belang. Terwijl talrijke potentiële behandelingen pokkenvirus infectie bestrijden zijn geïdentificeerd, het enige door de FDA goedgekeurde therapie effectief voor de behandeling pokkenvirus infectie het acyclische nucleoside fosfonaat, cidofovir, en behandeling met vaccinia immunoglobuline ^9,10. Ondanks de uitroeiing van pokken in 1977 ^11, poxviruses blijven een belangrijke bedreiging voor de gezondheid van de mens ^12. Stopzetting van wijdverbreide vaccinatie tegen variolavirus heeft geleid tot een verhoogde gevoeligheid voor andere pokkenvirussen ^13. Bijvoorbeeld, zijn de regio's van Centraal-Afrika eerder door vaccinatie beschermd ervaren van een stijging van de Apenpokken virusinfecties ^14. Belangrijke zorg is ookgeuit over de latente gevoeligheid voor opzettelijke vrijlating van variolavirus. Vanwege de beperkte therapieën die momenteel beschikbaar zijn, is er een dringende behoefte aan ontwikkeling van nieuwe behandelingen. Deze verslaggever virussen toestaan ​​snelle en high-throughput klein molecuul-remmer screening op remming van een specifieke fase van virale replicatie. Identificatie van remmers die virale uitdrukking stadia richten momenteel niet het doelwit van remming zal de ontwikkeling van combinatietherapieën vergemakkelijken met een verhoogde potentie.

Er kan veel worden afgeleid over vacciniavirussen celbiologie door het observeren van veranderingen in elke fase van de genexpressie. Verzwakking door chemische of genetische manipulatie van een geïnfecteerde gastheercel wordt typisch uitgedrukt als de virale titers. Echter, door veranderingen in elke fase van de virale expressie cascade vergelijken, kan een vollediger begrip van hoe virus fitness effect is te vindened door een bepaalde behandeling. Deze gegevens zijn getoond om goed correleren met de traditionele virustiter uitgang, maar meer gedetailleerde mechanistische informatie en high throughput mogelijkheden ^7.