Hot Biologische Katalyse: Isothermisch titratiecalorimetrie om enzymatische reacties karakteriseren

Kwantitatieve bepaling van biochemische reacties geeft inzicht in de biologische processen die aan de basis van het leven. Calorimetry biedt een label-free methode om kwantitatief karakteriseren vrijwel elke chemische reactie in oplossing. Deze techniek meet de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd in de tijd, en dus een universeel detectiesysteem en een zeer gunstige methode om de hoeveelheid reagerende moleculen (bijvoorbeeld binding thermodynamica), alsmede de reactiesnelheid (dwz kinetiek) meten kwantificeren. Met name isothermische titratie calorimetrie (ITC) goedgekeurd als mogelijk om deze de thermodynamica van biomoleculaire evenwichten karakteriseren, waarbij eiwit-ligand, eiwit-eiwit, eiwit-metaalionen en eiwit-DNA-interacties ^1-6. Bovendien is het vermogen van ITC kinetische informatie maakt het een zeer krachtig systeem enzym katalyse meten, hoewel het potentieel van deze toepassing nogonderschat ^7-9.

De Michaelis-Menten-vergelijking ¹⁰ is een kwantitatieve beschrijving van enzymatische reacties, omdat het een relatie tussen de reactiesnelheid en de substraatconcentratie, afhankelijk van twee kinetische parameters: de Michaelis-constante _(KM) en de katalytische snelheidsconstante _(kcat) . De _kcat / _M-verhouding wordt aangeduid als de katalytische efficiëntie van een enzym. In de praktijk bepalen van K _M pt k _kat voor een specifieke reactie geeft een volledige beschrijving van de katalyse.

Bij een kenmerkende enzymatische reactie (figuur 1), een substraat (S) samenwerkt met het enzym (E) die het enzym-substraat (ES) complex, dat vervolgens in de overgangstoestand is geactiveerd (ES *). Deze wordt omgezet in het enzym-product (EP) complex dat uiteindelijk dissocieert. Deze staps worden beschreven door de volgende reactie.

(1)

waarin k ₁ is de snelheidsconstante voor de vorming van het ES-complex, k _-1 is de snelheidsconstante voor de dissociatie van het ES-complex, terwijl _kcat de snelheidsconstante of katalytische omzettingsgetal.

Volgens de Michaelis-Menten-vergelijking ^10, kan de snelheid van de reactie als volgt berekend:

(2)

waarbij K = _M (k _-1 + k _cat) / k ₁ pt k _cat = v _max / [E] met v _max wordt de maximale snelheid bereikt wanneer alle enzym gebonden aan het substraat.

De isothermische titratie calorimeter is het instrument in deze studie om de enzymatische hydrolyse van ureum karakteriseren. Dit instrument bestaat uit een adiabatische schild met twee gemunt-vormige cellen (Figuur 1). Deze zijn verbonden met de buitenzijde met smalle toegang buizen. De monstercel (ca. 1,4 ml) wordt geladen met de enzymoplossing, terwijl de referentiecel algemeen gevuld met water of met het oplosmiddel dat voor de analyse. Een roterende spuit met een lange naald en een roer paddle bevestigd, en doorgaans ca.. 0,3 ml substraatoplossing, is gemonteerd op de monstercel. Een thermo-elektrische apparaat meet het verschil in temperatuur tussen het monster en de referentie-cel en, met behulp van een "cel feedback netwerk", stelt zij dit verschil op nul door het optellen of aftrekken van warmte. Tijdens het experiment, wordt het substraat geïnjecteerd in de enzymoplossing op een constante gewenste temperatuur. Wanneer de nlzymatic reactie plaats, de hoeveelheid vrijkomende warmte of geabsorbeerd is evenredig met het aantal substraat moleculen die worden omgezet in product moleculen. Daarnaast wordt de snelheid van warmtestroom direct gerelateerd aan de snelheid van de reactie. De meetgegevens, die als afwijking van de verwarmingskabel uit nulmeting (figuur 1), vertegenwoordigen de thermische (μcal / s) geleverd door het instrument op de monstercel, dat evenredig is met de warmtestroom zich in de monstercel na verloop van tijd.

Figuur 1. Schematische weergave van isothermische titratie calorimeter enzymatische reacties bestuderen. Een enzymatische reactie die optreedt bij titratie van het substraat (in de injectiespuit) in de enzymoplossing (in de monstercel) resulteert in een verandering van de thermal macht vrijgegeven door de calorimeter, die nodig zijn om het verschil in temperatuur tussen het monster cel en de celverwijzing constant te houden. Klik hier voor grotere afbeelding.

Kortom, de warmteverandering (Q) is evenredig met de molaire enthalpie van de reactie (AH) en het aantal molen product verkregen (n), die op zijn beurt wordt gegeven door het totale maal de concentratie:

(3)

De productvorming in tijd (dP / dt), die overeenkomt met de reactiesnelheid kunnen dus worden gerelateerd aan de hoeveelheid warmte die via gelijktijdig (dQ / dt) door de relatie:

(4)

Volgens deze vergelijking om een Michaelis-Menten vinden plot dient te meten i) de totale molaire enthalpie AH, en ii) de warmtestroom dQ / dt bij verschillende substraatconcentraties. Gewoonlijk wordt dit in twee verschillende experimenten: in het eerste experiment (methode 1, M1), wordt het substraat geïnjecteerd in de enzymoplossing en de warmte voor volledige omzetting van het substraat wordt gemeten; in de tweede proef (Methode 2, M2), zijn meerdere injecties substraat uitgevoerd en de snelheid van de warmteproductie gemeten bij verschillende substraatconcentraties. Deze twee sets gegevens zijn voldoende om de kinetische parameters K _M pt k _kat ontlenen.

In dit artikel wordt een algemeen protocol om de kinetische parameters voor enzymatische reacties uitgevoerd met behulp van ICT te bepalen beschreven. We pasten de methode om ureum hydrolyse door Canavalia ensiformis ureumse, als referentiesysteem. De goede overeenkomst tussen de zo verkregen resultaten en de gegevens in de literatuur toont de betrouwbaarheid van deze benadering.