Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol
Summary
Mikroglia hücre dışı bir ortamda malzemenin fagosite veya yutmak için yüksek bir kapasitesi olan merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Burada, sinaptik bileşenlerin mikroglia aracılı yutulmasına görselleştirme ve ölçmek için, genel olarak, uygun ve güvenilir olup, kantitatif analiz tarif edilmektedir.
Abstract
Fagositoz bir hücre kendi çevre hücre dışı ortamda malzeme (tüm hücre, bir hücre, kir, vb parçaları) yutar ve daha sonra genel olarak lızozomal bozulma ile, bu malzemenin sindirir edildiği bir süreçtir. Mikroglia fagositik işlevi, nörodejeneratif hastalık, sağlıklı beyin gelişimine (Alzheimer hastalığında, örneğin, beta-amiloid açıklık) (örneğin, sinaptik gelen geniş bir koşullar aralığı içinde tarif edilmiştir, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yerleşik bağışıklık hücreleri budama) 1-6. Aşağıdaki protokol, gelişmekte olan fare retinogeniculate sisteminde 7 presinaptik girişlerin mikroglia aracılı yutulmasına görselleştirmek ve ölçmek için geliştirilmiş bir yutulma deneyidir. Bu deney, bu özel bağlamda mikroglia fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır iken, benzer bir yaklaşım, beyin (örneğin, astrositler) ve vücudun geri kalanı boyunca diğer fagositler değerlendirmek için kullanılabilirler(Örneğin, periferik makrofajlar) hem de sinaptik yeniden cereyan ettiği diğer bağlamlarda (örneğin, beyin hasarı / hastalığı).
Introduction
Sinaptik devreler bir hayvanın ömrü boyunca pişmanlık. Gelişmekte olan beyindeki sinapslar aşan formu ve sinapsların bir alt kümesinin seçici çıkarılması ve 8-10 kalır bu sinapsların bakım ve güçlendirilmesini içeren sinaptik budama geçmesi gerekir. Bu işlem, yetişkin sinir sisteminin kesin bağlantı özelliği elde etmek için gereklidir. Yetişkinde, sinaps, özellikle öğrenme ve hafıza bağlamında, plastik olabilir. Bu plastisite yapısal bağıntılar dendritik dikenler ve presinaptik boutons 11-13 ve buna ek olarak ve / veya eleme düşünülmektedir. Sağlıklı bir sinir sisteminin bu rollerinin yanı sıra, aynı zamanda yeniden sinaptik sinir sistemi hastalığı / yaralanması 12,14,15 katılır. Örneğin, omurilik yaralanması sonrasında, kopmuş akson sonradan pişmanlık ve fonksiyonel iyileşme 16-19 ulaşmak için yeni sinaps oluşturmak gerekir.
nt "> sinaptik plastisite önemli bir yönü olarak Yükselen fagositoz veya kaldırılması 3,5,20 için mukadder sinaps yutulma sürecidir. Biz son zamanlarda sağlıklı, doğum sonrası fare beyninde 7 sinaptik budama bağlamında bu olayı göstermiştir. Özellikle , mikrogliya, ikamet MSS bağışıklık hücreleri ve fagositler, bir zirve döneminde ve gelişimsel sinaptik budama, talamus doğum sonrası sırt yanal genikülat çekirdek (DLGN) bir bölgede presinaptik girdiler yutmak için gösterildi., bu yutulma genetik veya farmakolojik blokajı sinaptik bağlantı sürdürülebilir açıkları sonuçlandı.Bu protokol, biz presinaptik girişlerin phagocyte aracılı yutulmasına ölçmek için güvenilir ve yüksek kantitatif analiz tanımlamaktadırlar. Bu makalenin amaçları için, bu deney, retinada bulunan retinal ganglion hücreleri içeren gelişmekte retinogeniculate sistemi (RGCs) bağlamında sunulan olacakDLGN (Şekil 1A) presinaptik girdiler proje. Öncelikle, bir lizozomal bozulma dayanıklı ileriye etiketleme strateji DLGN RGC spesifik presinaptik giriş (Şekil 1) 7,21 görselleştirmek için kullanılan, tarif edilecektir. Bu açıklama, görüntüleme için detaylı bir yöntem izlenerek ve kantitatif olarak 3 boyutlu (3D) bir yüzey işleme hacmi ile kombine konfokal mikroskopi kullanılarak yutulmasına ölçüm verilecektir. Bu yöntem, sabit bir doku terkibi göre değil, aynı zamanda, canlı görüntüleme çalışmaları içinde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Tahlil, sağlıklı, doğum sonrası retinogeniculate sistemi bağlamında doğrulandıktan ise Önemli olarak, başka bir beyin boyunca ve hastalığı sırasında fagosit-nöron etkileşimler, hem de diğer organ sistemlerinde fagosit fonksiyonunu değerlendirmek için aynı teknikler uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doğru fagositoz ölçmek amacıyla, yuttu malzeme lizozomal bozulma oluştu kez araştırmacı bunu görselleştirmek şekilde etiketlenmesi gerekmektedir. Buna ek olarak, yüksek çözünürlüklü görüntü tüm hücre hacmini görselleştirmek ve içeriğini ölçmek için araştırmacı sağlayacak bir yazılım kullanımı ile, ardından gereklidir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyon ile birlikte yuttu malzemeyi etiketlemek için Alexa boyalar konjuge CTB kullanarak…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
,,, NRSA (DPS F32-NS-066698); Çalışma Smith Aile Vakfı (BS), Dana Vakfı (BS), John Merck Bilginleri Programı (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801) hibe tarafından desteklenmiştir Nancy Lurie Marks Vakfı (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Görüntüleme Çekirdek).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
Referências
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer’s disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington’s disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
