Визуализация эндосоме Dynamics в живых нервных окончаний с Четырехмерное флуоресценции изображений

Покадровый визуализации живой ткани обеспечивает визуальный доступ к динамических структурно-функциональных отношений, которые не могут быть оценены в фиксированных или живых препаратов отображаемого в одной точке во времени. Часто, однако, плата за доступ к временной информации является уменьшение оптическим разрешением. Высокие цели масло-погружные числовая апертура непрактичны в живой ткани из-за их узкого круга внимания, оставляя погружение в воду или сухие целей в качестве единственных альтернатив. Кроме того, повышенное разрешение, обеспечиваемая конфокальных оптики не могут быть использованы в некоторых живых препаратов из-за фототоксичности от относительно высоких уровней освещенности, необходимых ^1,2. Наконец, в то время как несколько в режиме реального времени или покадровой оптические методы доступны, что предложение улучшенное разрешение, их применимость ограничена препаратов, где структуры интересов могут быть расположены в пределах нескольких сотен нанометров в цели ^1. Способ, описанныйиспользует относительно недорогое оборудование, является универсальным, но предлагает улучшенное разрешение по сравнению с более часто используемых методов покадровой. Он предназначен для использования в отдельных лабораторий, а также изображений объектов.

Способ использует обычную эпифлюорисцентной микроскопии, в сочетании с чувствительным цифровой камеры и с средств, предназначенных для быстро приобретать наборы изображений при слегка различных фокальных плоскостях (Z-стеки). Каждый Z-Stack имеет цифровую deconvolved увеличить разрешение. Одной из особенностей 3D покадровой (4D) изображений является точным сопровождение движущихся органеллы или другие структуры. При правильной настройке, распечатанных структуры не идут не в фокусе, и движение во всех трех направлениях можно наблюдать и количественно. Таким образом, невозможно для окрашенных структура исчезнуть в течение одного или нескольких покадровой кадров просто дрейфующими выше или ниже узкой фокальной плоскости. Способ также служит в качестве чувствительного инструмента для оценки взаимодействия и возможного фуСион малых структур. Обычные эпифлуоресцентная или конфокальной образы структур вблизи дифракционного предела (несколько сотен нм) не подтверждают слияние даже если объединены изображения показывают перекрытие их соответствующих этикеток ^3. Fusion предлагается, но остается возможность, что объекты разделены горизонтально или вертикально на расстоянии, которая находится ниже дифракционного предела. Три или четыре-мерной визуализации, напротив, допускает просмотр предметов в каждом из трех ортогональных направлений. Появление синтеза во всех трех видах повышает уровень достоверности. И, в некоторых живых препаратов, направленных или броуновское движение предположительно конденсированных объектов предоставляет дополнительные доказательства, когда обе метки двигаться вместе со временем. Конечно, когда рядом с дифракционного предела уровень определенности в требовательных структур из фоне, или показывая, что они содержат две красители (фьюжн), не является абсолютным. Если это применимо, специализированные методы, такие как флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET)^4, являются более подходящими.