Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial<em> En Vivo</em
Summary
Inhibición presináptica GABAérgicas es un poderoso mecanismo inhibitorio en la médula espinal importante para el motor y la integración de la señal sensorial en las redes de la médula espinal. Subyacente despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de la raíz dorsal (DRP). Aquí se demuestra un método de grabación en vivo de DRP en ratones.
Abstract
La inhibición presináptica es uno de los más poderosos mecanismos inhibitorios en la médula espinal. El mecanismo fisiológico subyacente es una despolarización de las fibras aferentes primarias mediada por sinapsis GABAérgicas axo-axonales (despolarización aferente primaria). La fuerza de la despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de volumen-llevado a cabo en la raíz dorsal (potenciales de la raíz dorsal, DRP). Los cambios patológicos de la inhibición presináptica son cruciales en la central de procesamiento anormal de ciertas condiciones de dolor y, en algunos trastornos de la hiperexcitabilidad del motor. Aquí se describe un método de DRP grabación en vivo en ratones. Se explica la preparación de las raíces dorsales de la médula espinal en el animal anestesiado y el procedimiento de registro con electrodos de succión. Este método permite medir GABAérgica DRP y por lo tanto la estimación de la inhibición presináptica de la médula en el ratón vivo. En combinación con modelos de ratones transgénicos, la grabación puede DRP sírve como una herramienta poderosa para investigar la enfermedad asociada a la columna vertebral fisiopatología. In vivo la grabación tiene varias ventajas en comparación con las preparaciones in vivo de médula espinal aisladas ex, por ejemplo, la posibilidad de grabar o la manipulación de las redes supraespinales y la inducción de DRP por la estimulación de los nervios periféricos simultánea.
Introduction
La inhibición presináptica es uno de los más poderosos mecanismos inhibitorios en la médula espinal. Inhibe los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSPS) en motoneuronas monosinápticamente excitados sin cambiar el potencial de la membrana postsináptica y la excitabilidad de las motoneuronas 1-3. Despolarización aferente primaria (EAP) inducida por la sinapsis GABAérgicas axo-axonal presináptica sobre las fibras sensoriales es el mecanismo subyacente 4-7 (véase también Figure1a). Estas sinapsis contienen GABA A y GABA-B (receptores GABA A y GABA B R R). La actividad de GABA A R conduce a un aumento en la conductancia de cloruro que provoca PAD debido a la distribución de iones local. Esta despolarización bloques de la propagación de potenciales de acción en los terminales de los axones y reduce su fuerza que conduce a una disminución de Ca 2 +-afluencia y la reducción de la liberación del transmisor. La activación de los receptores GABA B no hacet contribuyen a PAD, pero conduce a una reducción de la Ca 2 +-afluencia mejorando así la inhibición presináptica. Mientras que la activación de GABA A R parece estar implicado en la inhibición a corto plazo, el GABA B R están implicados en la modulación de largo plazo 8-10. Además de GABA, que representa la mayor parte de la PAD y la inhibición presináptica, otros sistemas transmisores también podrían modular y contribuir a este mecanismo de 11,12.
Los cambios patológicos en la inhibición presináptica parecen ser cruciales en varios estados de enfermedad, por ejemplo, la inflamación y el dolor neuropático periférico 13,14, así como el procesamiento anormal de dolor central 15, lesión de la médula espinal 16, y enfermedad del SNC con hiperexcitabilidad del motor mediada por la transmisión GABAérgica defectuoso 17, 18. Por lo tanto, la estimación de la inhibición presináptica la pena investigar las condiciones patológicas experimentales a nivel de la médula espinal en vivo </em>. PAD da lugar a potenciales de volumen llevado a cabo proporcionando una medida directa de la inhibición presináptica en la médula espinal. Esas posibilidades se denominan potenciales de la raíz dorsal (DRP) y pueden ser medidos de las raíces dorsales de la médula espinal después de la estimulación de las raíces dorsales adyacentes 7.
Las primeras mediciones de DRP se han reportado en los gatos y ranas 19 y fueron intensamente estudiado en gatos por Eccles, Schmidt, y otros en la década de 1970 3,4,20,21. Mientras grabaciones in vivo de DRP en los gatos 22 y 23 ratas han sido ampliamente utilizados, las mediciones en los ratones se han realizado casi exclusivamente en preparaciones aisladas ex vivo de la médula espinal 15,24. Aquí, se describe un método para grabar DRP en ratones anestesiados in vivo que permite una medida directa de la inhibición presináptica en el organismo intacto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Extra-e intracelulares registros electrofisiológicos de la actividad neuronal y sináptica potenciales in vivo son el estado de las técnicas más avanzadas en la investigación de las funciones neuronales del sistema nervioso central y la fisiopatología. Integración espinal es fundamental para la función del motor, por ejemplo, el movimiento de las extremidades y de la percepción sensorial multimodal. Inhibición presináptica es un mecanismo fundamental en este proceso computacional asegurar res…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Manfred Heckmann útil para los debates durante el establecimiento del método. Además, agradecemos a Claudia Sommer para la asistencia técnica y Frank Schubert para la producción del vídeo de la ayuda. El trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF), Alemania, FKZ: 01EO1002 y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) del Hospital de la Universidad de Jena.
Materials
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| (Melsungen, Germany) | |||
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamin 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30G micro needle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| (Melsungen, Geramny) | |||
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| Stimulator | |||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Data acquisition | |||
| Universal amplifier | npi (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
Referências
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